英文題目：Identifification of epilepsy-associated neuronal subtypes and gene expression underlying epileptogenesis

中文題目：鑒定癲癇相關的神經(jīng)元亞型和誘發(fā)癲癇的基因表達

發(fā)表時間：2020年10月7號

影響因子：12.121

研究背景

癲癇是一種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，具有自發(fā)性和反復發(fā)作的特征，其主要發(fā)生在海馬體或大腦皮層區(qū)域。人們對癲癇的病理生理學仍然知之甚少。雖然有一些動物模型研究顯示某些神經(jīng)元亞型對癲癇發(fā)作的產生和傳播有一定的促進作用，但在人類癲癇患者的相應數(shù)據(jù)卻很少。這是由于癲癇發(fā)生過程中復雜的神經(jīng)網(wǎng)絡現(xiàn)象。

實驗方法

10x snRNA-seq，Smart-seq2?snRNA-seq，RNA-seq，ISH等

結論

該項研究揭示了癲癇對神經(jīng)元轉錄的不同影響—即雖然許多亞型表現(xiàn)出輕微的基因表達變化，但其對一些特定的SUB型主要神經(jīng)元和GABA能間神經(jīng)元產生了很大的影響。

結果

一、癲癇皮質中與疾病相關的神經(jīng)元亞型

為了識別哪些神經(jīng)元亞型受癲癇影響或導致癲癇，文章中比較了來自癲癇性顳皮質和非癲癇性顳皮質的snRNASeq數(shù)據(jù)，研究結果表明，在一些位置，例如，皮層上層L2_Cux2_Lamp5和L2-3_Cux2_Frem3，在癲癇和非癲癇的皮層產生的神經(jīng)元之間存在明顯的轉錄組轉移(圖1a)。此外，盡管癲癇病和非癲癇病樣本中每個亞型的神經(jīng)元數(shù)量大致相似，但觀察到幾種亞型中已被鑒定的細胞核數(shù)量顯著減少(圖1b)。在癲癇患者中，L2/3亞型的數(shù)量減少了，當對每種情況下的序列神經(jīng)元總數(shù)進行歸一化時，這種減少更加明顯(圖1c)。對于中間神經(jīng)元，Pvalb_Sulf1亞型的神經(jīng)元數(shù)量減少較多(圖1c)。

通過基因表達相關性分析，發(fā)現(xiàn)癲癇和非癲癇神經(jīng)亞型之間的巨大差異(圖1d)，這可能表明癲癇對其轉錄組有特定的影響。對于主要神經(jīng)元，L5-6_Fezf2_Tle4_Abo、L5-6_Themis_Ntng2、L2_
Cux2_Lamp5和L2-3_Cux2_Frem3亞型在癲癇和非癲癇皮質中轉錄組差異大(圖1d)。對于gaba能間神經(jīng)元，在癲癇發(fā)作的顳葉皮層中，Vip_Cbln1、Sst_Tac1、Pvalb_Sulf1、Pvalb_Nos1和Id2_Lamp5_Nos1的轉錄組改變大。同時也證實了癲癇相關DE基因在具有較大轉錄組差異的神經(jīng)元亞型中普遍存在(圖1e、f)。

圖1癲癇和非癲癇數(shù)據(jù)集的整合和疾病相關神經(jīng)元亞型的鑒定

二、共有和亞型特異性癲癇相關途徑

作者計算了每種已鑒定亞型GO中DE基因的富集程度，一些神經(jīng)元亞型在癲癇中表現(xiàn)出了大的轉錄組改變(>100豐富的GO)，但多數(shù)神經(jīng)元亞型中只有少數(shù)GO，特別是對于生物過程(BP)來說，這應該與通路的生物學功能相關(圖2a)。這些受影響較小的亞型中，大多數(shù)在癲癇細胞和非癲癇細胞之間也具有高的基因表達相關性(圖1d)，從而證實癲癇和非癲癇之間轉錄組相關性高的亞型中，癲癇改變的信號通路也較少。

根據(jù)GO分析，發(fā)現(xiàn)一些Sst亞型、Vip_Cbln1和Id2_Lamp5亞型顯示DO高度富集，如局灶性癲癇(DOID:2234)、癲癇綜合征(DOID:1826)和顳葉癲癇(DOID:3328)。此外，還發(fā)在L3_Cux2_Prss12、L5-6_Fezf2_Lrrk1_Sema3e和L5-6_Fezf2_Tle4_Abo主要神經(jīng)元亞型中富集的與癲癇相關的DO相同。這表明，與癲癇相關的DO在不同的神經(jīng)元亞型中富集差異很大，與谷氨酰胺能細胞相比，在GABAergic和Sst亞型Vip_Cbln1和Id2_Lamp5中，癲癇相關的DO在GABAergic和Sst亞型Vip_Cbln1和Id2_Lamp5中富集更廣泛，顯示出對癲癇的特殊易感性。

圖2神經(jīng)元亞型中癲癇相關通路和轉錄轉移的鑒定

三、癲癇活動的信號通路

谷氨酸受體，尤其是AMPA受體被證明是癲癇發(fā)作的主要驅動力之一，在篩選出缺乏表達的基因后，尋找富含與奮性相關轉錄組學變化的亞型，并從這些GO項中繪制DE基因（圖3a–d）。CKAMP44是貫穿整個顳葉皮質的主要AMPA受體輔助亞基，這一事實也強調了CKAMP44上調的重要性(圖3c, d)。癲癇對AMPA受體輔助亞基編碼基因的上調有相當普遍的影響。

多種谷氨酸受體亞基和神經(jīng)元活性相關基因表達復雜失調，其中大部分在癲癇中未見報道。因此,雖然大多數(shù)的基因編碼谷氨酸受體亞基表達上調(GRIA1、GRIA3 GRIA4, GRIK3, GRIK4, GRIK5, GRIN2B, GRIN3A, GRM1, GRM7,和GRM8),但一些是表達下調(GRIA2、GRIA3 GRIN2A, GRM5, GRIK1,和GRIK2)(圖3?b, c)。

圖3鑒別可能導致癲癇發(fā)作的皮層神經(jīng)元亞型的信號通路和基因

癲癇患者皮層谷氨酸介導興奮相關基因顯著分層上調或下調。作者用單分子熒光原位雜交(smFISH)方法標記了幾個高度調控基因的mRNA。如上所述，在主要神經(jīng)元的亞型中，編碼AMPA輔助亞基的許多基因分層上調。因此，在一組癲癇和非癲癇樣本的皮質切片中標記了CKAMP44 mRNA，通過與Rorb和DAPI共標記，并確定了L2/3、L4和L5/6的位置(圖4b)。重要的是，證實了各層中CKAMP44的表達顯著上調(圖4b)。

圖4癲癇患者皮層谷氨酸介導興奮相關基因的復雜分層失調

四、受癲癇影響的基因網(wǎng)絡

在癲癇樣本中，六個與癲癇密切相關的模塊上調，六個下調。另外，在細胞水平分析中突出的幾個涉及過度興奮信號和癲癇發(fā)作的基因也是一個或多個癲癇相關基因模塊的成員。編碼谷氨酸受體亞基的基因也廣泛存在于癲癇相關模塊中。這些基因共表達分析捕獲了主要神經(jīng)元L5-6_Fezf2_Tle4_Abo和L2-3_Cux2亞型中活躍的核心轉錄網(wǎng)絡。與癲癇狀態(tài)相關的基因模塊指向與突觸和離子通道相關的轉錄變化，包括AMPA受體輔助亞基、谷氨酸受體亞基和電壓門控鈉通道，這些可能與癲癇回路異常高的興奮有關。同時觀察到主要神經(jīng)元和GABAergic間神經(jīng)元的受影響的亞型根據(jù)豐富的GO項的相似性聚集在一起(圖5b)。因此，L2-3_Cux2和L5-6_Fezf2亞型與Sst_Tac1和Vip_Cbln1亞型共聚，而L3_Cux2_Prss12亞型與Pvalb_Sulf1亞型共聚，這可能是癲癇轉錄組中受影響嚴重的局部神經(jīng)網(wǎng)絡的基礎。

圖5綜合分析癲癇易受影響的神經(jīng)元亞型

結論

總之，該研究通過單核轉錄組測序（snRNA-seq）發(fā)現(xiàn)癲癇患者的神經(jīng)轉錄組發(fā)生了大規(guī)模而復雜的變化，其中一些亞型表現(xiàn)出了明顯的癲癇驅動的基因表達異常，而其他亞型則大部分未受影響。癲癇相關的轉錄組改變可以聚集成包含多個神經(jīng)元亞型的模塊，這些神經(jīng)元亞型可能是受癲癇影響的不同神經(jīng)元聚集的基礎。未來需要在小鼠模型和人類組織中進行轉化研究，以解決哪些已確定的通路導致癲癇的產生和傳播，以及哪些更能代表神經(jīng)網(wǎng)絡的穩(wěn)態(tài)可塑性。

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動物細胞圖譜分析繪制案例：黑腹果蠅

中文標題：果蠅細胞圖譜：成年果蠅的單核轉錄組圖譜

英文標題：Fly Cell Atlas: A single-nucleus transcriptomic atlas of the adult fruit fly

期刊：Science[IF: 63.714] 2022.3.4

DOI：10.1126/science.abk2432

實驗設計

實驗材料：黑腹果蠅

實驗方法：解剖了來自雌性和雄性黑腹果蠅的12個組織（觸角、體壁、脂肪體、平衡棒、心臟、腸道、腿、馬氏管、絳色細胞、喙和下顎須、氣管、翅膀）以及3個性別特異性組織（雄性生殖腺、睪丸、卵巢）。對于遍布全身的組織使用特異性GAL4驅動核-GFP蛋白，再用流式細胞熒光分選技術標記和收集細胞核，進行單細胞核snRNA-seq

測序策略：單細胞核轉錄組10x Genomics、Smart-seq2

研究內容

黑腹果蠅在生物學研究方面有著豐富的歷史，以往研究探索了其不同組織中的表達模式，但缺乏細胞類型分辨率級別的數(shù)據(jù)庫。近年來單細胞技術的進步使得同時對數(shù)千個細胞進行轉錄組分析成為可能，促進了全組織細胞圖譜的創(chuàng)建。然而，現(xiàn)有scRNA-seq數(shù)據(jù)集來自不同實驗室，是基于不同遺傳背景，不同分離方法以及不同測序平臺產生的，阻礙了跨細胞和組織的基因表達的系統(tǒng)性分析。

該研究通過對果蠅多組織進行單細胞核轉錄組測序后，得到了果蠅細胞圖譜。之后對15個組織進行詳細的細胞注釋，在果蠅頭部，注釋到了81種主要的神經(jīng)細胞類型，在果蠅的軀體中注釋了最豐富的33種細胞類型。該圖譜還可用于進行相同細胞的跨組織分析，作者通過分析血細胞在整個組織中的表達情況，發(fā)現(xiàn)了血細胞中最常見的細胞類型——漿細胞，并未在成蟲血細胞中觀察到葉狀血細胞。通過對肌肉細胞在不同組織類型進行比較，發(fā)現(xiàn)它們主要在果蠅軀體、體壁和腿部有特定的富集，并發(fā)現(xiàn)內臟肌、骨骼肌、間接飛行肌的分離。

通過轉錄因子分析，找到了500個轉錄因子和細胞類型具有高特異性，繪制了每種細胞類型中特異轉錄因子的表達熱圖。此外，作者還使用SCENIC預測了基于共表達和motif富集的基因調控網(wǎng)絡。通過對廣泛細胞類型或組織的基因進行比較分析，發(fā)現(xiàn)了在各種細胞類型中的常見表達基因和特定表達基因。

通過對性別依賴的基因表達和性別特異性組織分析，發(fā)現(xiàn)體細胞中的主要性別決定基因doublesex（dsx）的表達在很大程度上不具有性別特異性，而許多其他基因的表達具有性別依賴。作者進一步對精母細胞和精細胞進行軌跡推斷，發(fā)現(xiàn)精母細胞期被轉錄的基因數(shù)量持續(xù)增加，許多強烈上調的基因在任何其他細胞類型中都沒有基本表達。然而，晚期精母細胞顯示了來自許多其他細胞類型的標記基因的表達。

果蠅細胞圖譜：成年果蠅的單核轉錄組圖譜

動物細胞圖譜分析繪制案例：食蟹猴

中文標題：食蟹猴單細胞轉錄組和調控組參考圖譜

英文標題：A reference single-cell regulomic and transcriptomic map of cynomolgus monkeys

期刊：Nature comuiations?[IF: 17.694]?2022.07.13

DOI：10.1038/s41467-022-31770-x

實驗設計

實驗材料：成年食蟹猴

實驗方法：選取16個器官（心、肝、脾、肺、腎、胃、結腸、肌肉、氣管、主動脈、脂肪、膀胱、舌頭、乳腺、子宮和睪丸）

測序策略：10x Genomics單細胞轉錄組測序（scRNA-seq）和單細胞染色質開放性測序（scATAC-seq）

研究內容

非人類靈長類動物（Non-human primates）在系統(tǒng)發(fā)育上與人類非常接近，在遺傳、器官發(fā)育、生理功能、病理反應和生化代謝等諸多方面表現(xiàn)出與人類相似的特征，是生物醫(yī)學研究和藥物開發(fā)的理想實驗動物模型。其中，最為典型的代表當屬食蟹猴。系統(tǒng)評估食蟹猴等非人靈長類動物模型與人類的細胞組成差異、器官異質性和基因表達時空特異性等在基礎研究中具有十分重要的價值。

該研究對成年食蟹猴的16個代表性器官進行單細胞轉錄組測序和單細胞染色質開放性測序，構建了食蟹猴多器官的單細胞多組學參考圖譜，將25萬個細胞進行 t-SNE降維聚類得到40余種不同的細胞亞群。

通過對該細胞圖譜進行分析，鑒定到了新的細胞類型。為了解析上皮細胞異質性，作者提取上皮細胞并進行亞群聚類分析。根據(jù)marker基因的獨特表達模式，分析鑒定出14個上皮細胞簇，包括基底細胞、分泌細胞、纖毛細胞和非纖毛細胞。纖毛上皮細胞在各種組織中都占很大比例，為了探索纖毛上皮細胞亞型的發(fā)育和功能動態(tài)，作者選用纖毛上皮細胞相對較多的器官，使用Monocle和RNA速度分析對纖毛上皮細胞進行軌跡分析，觀察到纖毛細胞從祖細胞狀態(tài)向成熟狀態(tài)分化的過程，沿著擬時間高表達的基因在與代謝過程、細胞對刺激的反應和防御反應相關的基因本體(GO)術語中順序富集。

使用CellPhoneDB細胞通訊分析，發(fā)現(xiàn)基質細胞、上皮細胞和髓系細胞之間存在強烈的細胞間相互作用。通常，細胞間相互作用的強度和模式是器官特異性的。為了重新繪制調節(jié)細胞-細胞相互作用的分子相互作用，作者在不同器官的特定細胞亞群中繪制了配體-受體對，揭示了猴子各種器官細胞間通信的潛在分子機制。

結合表達譜和染色質開放性數(shù)據(jù)，作者分析預測了控制不同細胞類型基因表達模式的關鍵調控子。發(fā)現(xiàn)SPIB、POU2F2、SPI1、CEBPD和IRF4是髓系細胞中的關鍵調控子；而FEV具有調節(jié)造血干細胞的潛能，該轉錄因子廣泛參與對免疫細胞和上皮細胞的基因表達調控。大多數(shù)順式調控元件(CREs或ATAC峰)來自啟動子、內含子或遠端基因間調控區(qū)。在scATAC-seq數(shù)據(jù)中預測了9種細胞類型，在RNA簇中發(fā)現(xiàn)了兩種罕見的細胞類型，單核細胞和循環(huán)B細胞，但在ATAC簇中沒有發(fā)現(xiàn)?？傊?，本文中的scATAC-seq數(shù)據(jù)為無偏見地發(fā)現(xiàn)食蟹猴的細胞類型和調控DNA元件提供了豐富的資源。

最后，作者進行了跨物種比較分析，通過整合分析器官匹配的單細胞轉錄組數(shù)據(jù)，探討了人、食蟹猴和小鼠三個物種之間的細胞組成和基因表達特異性。猴子和人類在同源基因表達方面表現(xiàn)出明顯高于其他比較的細胞類型相似性。其中，免疫細胞相較于非免疫細胞，人類和猴子之間的基因表達具有更高的相似性。間質細胞在人鼠和猴鼠比較中表現(xiàn)出最高的相似性。這些發(fā)現(xiàn)表明，猴子在免疫系統(tǒng)中與人類具有高度相似的轉錄程序，因此可能為研究對癌癥或新冠病毒COVID-19等疾病的免疫反應提供理想的模型。

食蟹猴多器官單細胞多組學參考圖譜構建與分析

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