2018年11月的“百邁客全國功能基因組學(xué)峰會(huì)”上，劉老師作為演講嘉賓在“微生物分會(huì)場(chǎng)”做了精彩匯報(bào)，小編清晰記得劉老師的演講題目為“The histone demethylase KDM5 regulates autism-like behavior by maintaining gut microbiota homeostasis”，當(dāng)她講到“孤獨(dú)癥”兒童的處境與狀態(tài)時(shí)，她眼神中流露出的悲憫深深感染了我，我想她對(duì)自己研究領(lǐng)域的熱愛與堅(jiān)持一定也是出自于這種情懷吧。
接下來，我們一起來了解下劉老師的這篇文章取得了哪些突出進(jìn)展吧！
研究背景
越來越多的研究表明，腸道菌群可以影響智力障礙（ID）和自閉癥譜系障礙（ASD）的疾病癥狀，盡管宿主的基因能夠影響腸道菌群，然而調(diào)控宿主共生菌群穩(wěn)態(tài)的分子機(jī)制在正常和疾病狀態(tài)下仍然未知。KDM5蛋白家族是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，它通過組蛋白H3K4me3去甲基化修飾來發(fā)揮作用，然而在ID和ASD患者中，KDM5A/KDM5B/KDM5C發(fā)生了功能喪失型基因突變。果蠅的腸道菌群結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，遺傳和生理易于操控，可以為宿主-微生物的互作研究提供良好的體系，此外攜帶與人類KDM5C（kdm5A512P）致病錯(cuò)義突變類似等位基因的果蠅表現(xiàn)出學(xué)習(xí)和記憶缺陷。與腸內(nèi)共生菌接觸的腸上皮細(xì)胞能夠細(xì)菌信號(hào)產(chǎn)生活性氧，劉老師課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，KDM5能夠調(diào)節(jié)果蠅的細(xì)胞氧化應(yīng)激，因此本研究旨在探究KDM5通過調(diào)節(jié)腸道菌群來影響果蠅社交行為的機(jī)制。
重要結(jié)論
1. KDM5的缺乏導(dǎo)致了果蠅腸上皮屏障受損和社交行為減退
?圖1. ?A：野生型（wt, w1118）和基因敲除型（kdm5K6801/10424）果蠅的KDM5, H3K4me3和組蛋白H3水平（Western blot）；B：wt和kdm5K6801/10424果蠅腸道組織KDM5轉(zhuǎn)錄水平（RNA-seq）；C：wt和kdm5K6801/10424果蠅消化道影像，紅框內(nèi)的斑點(diǎn)指示有腸道缺陷（氣泡）；D：3-5齡wt和kdm5K6801/10424果蠅的腸道缺陷（氣泡）比例；E：透射電鏡觀察wt和kdm5K6801/10424果蠅前、后中腸上皮屏障；F：藍(lán)色食用染料標(biāo)記、測(cè)量wt和kdm5K6801/10424果蠅的腸滲透性；G：異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的玻璃粉指示kdm5K6801/10424果蠅消化道滲透性較高；H：Myo1A-Gal4 TS/+和Myo1A-Gal4 TS/kdm5RNAi果蠅的頭、腸組織的KDM5, H3K4me3和組蛋白H3水平（Western blot）；I：藍(lán)色食用染料標(biāo)記、測(cè)量Myo1A-Gal4TS/+和Myo1A-Gal4 TS/kdm5RNAi果蠅的腸滲透性；J、K和N：與wt果蠅相比，kdm5K6801/10424果蠅的接觸距離變遠(yuǎn)、交往活躍度下降、雌性社交接觸時(shí)間變短；L、M和O：與Myo1A-Gal4 TS果蠅相比，Myo1A-Gal4 TS/kdm5RNAi果蠅也發(fā)生了接觸距離變遠(yuǎn)、社交活躍度下降、雌性交往接觸時(shí)間變短。
?2. KDM5調(diào)節(jié)果蠅的腸道菌群組成
?圖2. A：wt和kdm5K6801/10424果蠅“種”水平的腸道菌群類型；B：wt和kdm5K6801/10424果蠅腸道菌群OTU數(shù)目；C：wt和kdm5K6801/10424果蠅“門”水平的腸道菌群分層聚類；D：wt和kdm5K6801/10424果蠅“目”水平的腸道菌群相對(duì)豐度熱圖；E：3日齡wt、kdm510424、kdm5K06801、kdm5K6801/10424和kdm5k6801;gkdm5-HA果蠅腸道乳酸菌（Lactobacillus spp）數(shù)量（CFU/只）；F：4日齡wt、kdm510424、kdm5K06801、kdm5K6801/10424和kdm5k6801;gkdm5-HA果蠅腸道革蘭氏陰性菌數(shù)量（CFU/只）；G：wt和kdm5K6801/10424果蠅腸道革蘭氏陰性菌與陽性菌比例；H：wt和kdm5K6801/10424果蠅腸道L. plantarum L168和P. rettgeri P6豐度水平（q-PCR）；I：wt與kdm5K6801/10424、Myo1A-Gal4 TS/+與Myo1A-Gal4 TS/kdm5RNAi果蠅的中腸PH3正染色干細(xì)胞數(shù)目。
?圖3. A-E：采用wt果蠅的菌群重塑后，1日齡無菌wt和kdm5K6801/10424果蠅的腸道革蘭氏陰性菌數(shù)量（CFU/只）、乳酸菌（Lactobacillus spp.）數(shù)量（CFU/只）、革蘭氏陰性菌與陽性菌的比例、L. plantarum L168和P. rettgeri P6相對(duì)豐度（RT-PCR）、接觸距離、社交活躍度、雌性交往接觸時(shí)間比較；F-N：采用wt果蠅的菌群重塑后，4日齡無菌wt和kdm5K6801/10424果蠅的比較（同上述A-E）。
3. 對(duì)果蠅腸道菌群的調(diào)控緩解了KDM5缺乏所誘導(dǎo)的表型
圖4. A：無菌Myo1A-Gal4 TS/+和Myo1A-Gal4 TS/kdm5RNAi果蠅的接觸距離比較；B：3種培養(yǎng)基（營養(yǎng)物瓊脂、甘露糖瓊脂和革蘭氏陰性菌瓊脂）培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)日糧和抗生物添加日糧對(duì)kdm5K6801/10424果蠅腸道致病菌數(shù)量（CFU/只）的影響；C-E：標(biāo)準(zhǔn)日糧和植物乳桿菌對(duì)kdm5K6801/10424果蠅的腸道缺陷（氣泡）、接觸距離和社交活躍度的影響；F-J：標(biāo)準(zhǔn)日糧和植物乳桿菌（L. plantarum L168）添加日糧對(duì)kdm5K6801/10424果蠅的植物乳桿菌（L. plantarum L168plantarum L168Lactobacillus spp.）數(shù)量（CFU/只）、腸滲透性、腸道缺陷（氣泡）、接觸距離和社交活躍度的影響；K-L：標(biāo)準(zhǔn)日糧和乳酸菌（Lactobacillus spp.）添加日糧對(duì)Myo1A-Gal4 TS/kdm5RNAi果蠅的接觸距離和社交活躍度的影響；M-N：標(biāo)準(zhǔn)日糧和抗生素添加日糧對(duì)Myo1A-Gal4TS/kdm5RNAi果蠅的接觸距離和社交活躍度的影響；O-S：5-羥色氨（5-HT）分別在wt與kdm5K6801/10424果蠅、標(biāo)準(zhǔn)日糧與抗生物添加日糧飼養(yǎng)的kdm5K6801/10424果蠅、標(biāo)準(zhǔn)日糧與乳酸菌（Lactobacillus spp.）添加日糧飼養(yǎng)的kdm5K6801/10424果蠅、Myo1A-Gal4 TS/+與Myo1A-Gal4 TS/kdm5RNAi果蠅、標(biāo)準(zhǔn)日糧與乳酸菌（Lactobacillus spp.）添加日糧飼養(yǎng)的Myo1A-Gal4 TS/kdm5RNAi果蠅組間的濃度（ng/mg）比較。
4. KDM5對(duì)免疫缺陷（IMD/Rel）信號(hào)通路具有負(fù)調(diào)控作用
圖5. A-C：wt和kdm5K6801/10424果蠅腸道組織差異表達(dá)基因的分層聚類分析、GO富集分析和蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析；D：與wt果蠅相比，kdm5K6801/10424果蠅腸道組織的抗菌和先天免疫反應(yīng)基因相對(duì)表達(dá)（RT-PCR）；E：與kdm5K6801/10424果蠅相比，飼喂植物乳桿菌（L. plantarum L168）和抗生素日糧的kdm5K6801/10424果蠅腸道組織的抗菌和先天免疫反應(yīng)基因相對(duì)表達(dá)；F：wt和kdm5K6801/10424果蠅腸道組織的PGRP-LC基因結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄模式；G-H：wt與kdm5K6801/10424果蠅腸道組織imd、PGRP-LC-RA、PGRP-LC-RE基因啟動(dòng)子區(qū)域的KDM5水平和H3K4me3水平分析（ChIp-qPCR）；I：kdm5K6801/10424和Myo1A-Gal4 TS/kdm5RNAi果蠅腸道組織，以及S2細(xì)胞的全長PGRP-LC-RA和PGRP-LC-RE表達(dá)分析（RT-PCR）；J：wt和kdm5K6801/10424果蠅腸道組織的Relish免疫熒光染色；K：wt和kdm5K6801/10424果蠅腸道組織的Relish基因啟動(dòng)子區(qū)域的Relish水平分析（ChIp-qPCR）。
5. KDM5去甲基化酶的活性調(diào)節(jié)了IMD/Rel通路的活性和腸-菌-腦軸功能
?圖6. A：與kdm5k6801;gkdm5-HA果蠅相比，3-5日齡kdm5k6801;gkdm5JmjC*-HA（簡(jiǎn)稱kdm5Jmjc*）果蠅腸道組織的抗菌和先天免疫反應(yīng)基因的表達(dá)（RT-PCR）；B-C：3-5日齡kdm5k6801;gkdm5-HA和kdm5Jmjc*果蠅腸道的乳酸菌（Lactobacillus spp）、植物乳桿菌（L. plantarum L168）、P. rettgeri P6數(shù)量（CFU/只）；D：3-5日齡kdm5k6801;gkdm5-HA和kdm5Jmjc*果蠅中腸PH3正染色干細(xì)胞數(shù)目；E：3-5日齡kdm5k6801;gkdm5-HA和果蠅腸滲透性評(píng)估；F：異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的玻璃粉指示kdm5Jmjc*果蠅消化道滲透性較高；G-H：kdm5k6801;gkdm5-HA與kdm5Jmjc*果蠅的接觸距離和交往活躍度比較；I-K：標(biāo)準(zhǔn)日糧與植物乳桿菌（L. plantarum L168）添加日糧對(duì)kdm5Jmjc*果蠅消化道滲透性、接觸距離和交往活躍度的比較；L：kdm5k6801;gkdm5-HA和kdm5Jmjc*果蠅腹部組織的5-羥色胺（5-HT）濃度比較；M：標(biāo)準(zhǔn)日糧與植物乳桿菌（L. plantarum L168）添加日糧對(duì)kdm5Jmjc*果蠅5-HT濃度的影響。
6、抑制IMD信號(hào)通路可以改善KDM5缺乏導(dǎo)致的腸道失調(diào)和社交異常
圖7. A：四組（Myo1A-Gal4TS/+、Myo1A-Gal4TS/+; kdm5RNAi/+、Myo1A-Gal4TS/+; kdm5RNAi/ imdRNAi和Myo1A-Gal4TS+; imdRNA/+）果蠅的腸道革蘭氏陰性菌與陽性菌的比例；B：四組（如圖A）果蠅的腸道L. plantarum L168和P. rettgeri P6相對(duì)豐度；C：四組果蠅的腸滲透性、接觸距離、交往活躍度、交往接觸時(shí)間、5-羥色胺（5-HT）濃度比較。
總結(jié)
該研究從遺傳、環(huán)境和免疫因素進(jìn)行研究為“孤獨(dú)癥”的預(yù)防和治療提供了新思路。劉老師課題組以果蠅作為模型動(dòng)物，發(fā)現(xiàn)遺傳因素調(diào)控了固有的免疫信號(hào)通路，進(jìn)而造成了以腸道菌群結(jié)構(gòu)為代表的內(nèi)環(huán)境因素紊亂，導(dǎo)致免疫因素的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺濃度升高。然而，抗生素或植物乳桿菌飼喂以及抑制固有免疫的過度激活均可改善了KDM5基因功能缺乏導(dǎo)致的果蠅社交孤獨(dú)樣的“社交”行為、壽命和細(xì)胞表型，最終揭示了組蛋白去甲基化酶KDM5通過免疫系統(tǒng)和腸道菌群調(diào)節(jié)果蠅社交行為的機(jī)制。
通訊作者簡(jiǎn)介：劉星吟
南京醫(yī)科大學(xué)特聘教授，博士生導(dǎo)師。2006年獲得中山大學(xué)理學(xué)博士學(xué)位，2006年至2015年10月，先后在美國Rochester大學(xué)從事腸道病原微生物與宿主相互作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究。2010-2015年 在美國愛因斯坦醫(yī)學(xué)院從事自閉癥關(guān)聯(lián)基因的表觀遺傳學(xué)研究。2015.10作為高層次引進(jìn)人才受聘于南京醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院。2016.9月被評(píng)為南醫(yī)大特聘教授，2017年被評(píng)為江蘇特聘教授，目前擔(dān)任南京醫(yī)科大學(xué)腸道微生態(tài)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)的組長，主要致力于腸道微生物與人類疾病關(guān)聯(lián)的臨床和基礎(chǔ)研究。
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