遺傳圖譜作為經(jīng)典的研發(fā)方法，在功能基因定位中發(fā)揮著重要的作用，為群體遺傳學(xué)的發(fā)展做出了巨大貢獻(xiàn)。但是，遺傳圖譜同樣面臨著一個(gè)嚴(yán)峻問(wèn)題，就是難發(fā)高水平文章，即便有全基因組重測(cè)序或者簡(jiǎn)化基因組等高通量測(cè)序buff加持，如果無(wú)基因精細(xì)定位、克隆、驗(yàn)證等工作，沖擊5分以上文章略顯內(nèi)容單調(diào)。今天圖譜君給大家介紹一篇特別的文章，即通過(guò)RNA-seq的方法構(gòu)建遺傳圖譜，撇開(kāi)傳統(tǒng)思路，將轉(zhuǎn)錄組學(xué)和遺傳圖譜結(jié)合，共同進(jìn)行功能基因定位研究，希望各位科研汪能有所收獲！

 

背景

        基于DNA水平的重測(cè)序和簡(jiǎn)化基因組測(cè)序已經(jīng)在植物QTL定位研究中廣泛應(yīng)用，但是利用連鎖分析進(jìn)行基因表達(dá)研究較少。在這些研究中，將基因表達(dá)量作為一個(gè)性狀指標(biāo)，可以對(duì)表達(dá)基因進(jìn)行QTL分析，同時(shí)對(duì)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行研究。雖然甜瓜在果實(shí)品質(zhì)性狀上存在著廣泛的遺傳變異，但是對(duì)這些性狀的基因定位研究卻不多。在該研究中，作者構(gòu)建了甜瓜RIL群體的轉(zhuǎn)錄組圖譜，首先定位到2個(gè)果肉顏色、香味基因，然后對(duì)差異表達(dá)基因的調(diào)控順式/反式作用元件進(jìn)行eQTL定位。

材料方法

親本：414（非甜，淺橙色果肉，難聞氣味），Dul（甜味，深橙色果肉，芳香氣味）
群體：RIL，大小99
自然群體：148個(gè)甜瓜品種（具有多種果肉顏色）
性狀考察：129個(gè)代謝物含量和揮發(fā)性物質(zhì)含量（如類胡蘿卜素、生育酚、可溶性糖、乙烯釋放量、果肉顏色、果型等）
圖譜構(gòu)建：隱爾馬科夫模型估計(jì)重組bin
轉(zhuǎn)錄組測(cè)序：授粉10-20天，每個(gè)line取5株甜瓜的果肉混樣提取RNA，Illumina GAII和HiSeq 2000測(cè)序
互做網(wǎng)絡(luò)分析：eQTL互做網(wǎng)絡(luò)使用Cytoscape 2.8.2

結(jié)果分析

1、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及圖譜構(gòu)建

        每個(gè)樣品產(chǎn)生5-15M的100bp序列，與參考基因組比對(duì)獲得82140個(gè)SNP，甜瓜基因組預(yù)測(cè)有27427個(gè)基因，本研究共有16000個(gè)基因表達(dá)。以SNP為基礎(chǔ)劃bin，所有個(gè)體共檢測(cè)到6636個(gè)重組事件，產(chǎn)生3663個(gè)bin（圖1A），bin的平均長(zhǎng)度為72.6kb。遺傳圖譜構(gòu)建總圖距為2047cM，利用該圖譜進(jìn)行對(duì)之前未能掛載染色體的scffold進(jìn)行掛載，并對(duì)部分組裝錯(cuò)誤進(jìn)行了糾正（圖1B中圓圈）。

圖1? ? ? ?A）重組bin圖? ? ? ?B）標(biāo)記間關(guān)系熱圖

2、果實(shí)品質(zhì)性狀定位

        利用群體bin信息，對(duì)129個(gè)果實(shí)性狀（口味，顏色，香氣揮發(fā)性化合物）進(jìn)行標(biāo)記關(guān)聯(lián)，共檢測(cè)到241個(gè)QTL，QTL的平均區(qū)間大小為602kb，70%的QTL包含30個(gè)以內(nèi)基因。同時(shí)，通過(guò)4個(gè)已克隆基因（PH、CmACS7、CmMGL、CmAAT1）的重定位，驗(yàn)證了QTL定位的準(zhǔn)確性。

圖2? ? ? A）果實(shí)酸度和? ? ?B）果實(shí)長(zhǎng)度定位結(jié)果展示

3、CmThAT 1和CmPPR 1基因定位與驗(yàn)證

        S-methyl thioesters（s甲基硫脂）是一種揮發(fā)性脂類，對(duì)該性狀進(jìn)行QTL分析，在chr1定位到CmThAT 1基因，為驗(yàn)證CmThAT 1功能，將CmThAT 1轉(zhuǎn)入大腸桿菌進(jìn)行異源表達(dá)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)入CmThAT 1的大腸桿菌中s甲基硫脂顯著積累。同時(shí)發(fā)現(xiàn)在RIL群體中，s甲基硫脂的生成量與CmThAT 1基因的表達(dá)量呈正相關(guān)（r=0.66）。雙親CmThAT 1基因序列多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)，子代同親本Dulce多態(tài)性一致的個(gè)體與同親本414多態(tài)性一致的個(gè)體相比，CmThAT 1基因的表達(dá)量和s甲基硫脂含量均較高。

圖3 A）S-methyl thioesters生物合成過(guò)程和B）CmThAT 1定位結(jié)果

        類胡蘿卜素含量定位到49個(gè)QTL，其中chr 8上存在1個(gè)共定位基因CmPPR 1（圖4A），PPR蛋白家族與葉綠體和線粒體內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄后RNA編輯加工相關(guān)。雙親CmPPR 1基因外顯子內(nèi)存在5個(gè)SNP（3個(gè)位非同義突變），通過(guò)對(duì)148個(gè)自然群體材料CmPPR 1基因中非同義突變SNP的單體型與果肉顏色表型相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，第1外顯子C/G358與果肉白/綠相關(guān)，G/T441與淺橙/深橙色相關(guān)（圖4B）。

圖4 A）CmPPR 1基因定位和B）CmPPR 1不同SNP類型的表型

4、CmPPR 1影響葉綠體基因的表達(dá)

        在檢測(cè)到的16000個(gè)基因中，8405個(gè)基因在子代群體差異表達(dá)，對(duì)這些基因進(jìn)行eQTL分析，定位到12703個(gè)eQTL，其中34%為順式eQTL。在反式eQTL的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，CmPPR 1控制著30個(gè)基因的表達(dá)，其中27個(gè)為葉綠體靶向基因。另外，CmPPR 1受MELO3C002382調(diào)控，而MELO3C002382控制著33個(gè)葉綠體靶向基因。將CmPPR 1和27個(gè)葉綠體靶向基因的表達(dá)量與葉綠體基因組編碼基因的表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)兩者中大部分成負(fù)相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明這27個(gè)葉綠體靶向基因可能有著共同的功能通路。

圖5 A）CmPPR 1 eQTL調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和B）CmPPR 1調(diào)控的30個(gè)基因與葉綠體基因表達(dá)相關(guān)性

總結(jié)

        轉(zhuǎn)錄組遺傳圖譜不僅可以進(jìn)行傳統(tǒng)的圖譜構(gòu)建和QTL定位，還能夠進(jìn)行子代樣品間差異基因的分析，同時(shí)，結(jié)合遺傳圖譜與基因表達(dá)量的表型結(jié)果進(jìn)行更深一步的eQTL定位，揭示基因間的調(diào)控關(guān)系和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，更加快速和準(zhǔn)確挖掘候選基因。

 

        關(guān)于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序進(jìn)行遺傳圖譜的構(gòu)建已有多篇文章報(bào)道，圖譜君整理了一下，希望能給大家?guī)?lái)一些從未有過(guò)的思路?。⊕呙柘路蕉S碼下載文章原文?。?/p>