早在40年前，一代Sanger測(cè)序的出現(xiàn)，作為歷史性的轉(zhuǎn)折點(diǎn)，首次破譯人基因組序列；第二代測(cè)序（NGS）的發(fā)展，使得測(cè)序變得更快，更便宜，然而NGS具有自身的缺陷，其中最顯著的是其測(cè)序讀長(zhǎng)短，這成為基因組denovo中最大的障礙；近幾年來(lái)逐漸興起的三代測(cè)序技術(shù)（TGS）其獲得高質(zhì)量的測(cè)序數(shù)據(jù)的同時(shí)，在測(cè)序讀長(zhǎng)上具有重大突破（二代NGS測(cè)序無(wú)法跨越高重復(fù)，高雜合區(qū)域，所以不利于后續(xù)基因組的組裝）；三代（TGS）測(cè)序中可以很好的解決了高重復(fù)，高雜合基因組的組裝難題，使得基因組組裝指標(biāo)實(shí)現(xiàn)從Kb到Mb的跨越。目前常用應(yīng)用的是PacBio三代單分子熒光測(cè)序和Nanopore三代單分子納米孔測(cè)序。

圖1 三代Nanopore測(cè)序Long reads解決高重復(fù)（A）和高雜合（B）基因組組裝[1]

PacBio三代單分子熒光測(cè)序

利用與二代測(cè)序相同的邊合成邊測(cè)序的原理，而并不預(yù)先進(jìn)行PCR擴(kuò)增，有效的解決了二代測(cè)序建庫(kù)過(guò)程中需要PCR擴(kuò)增所產(chǎn)生的偏好性和錯(cuò)誤的問(wèn)題，可通過(guò)檢測(cè)單個(gè) DNA分子的合成所產(chǎn)生的信號(hào)來(lái)進(jìn)行測(cè)序，目前主要測(cè)序平臺(tái)為PacBio RSII和PacBio Sequel。

圖2 三代PacBio建庫(kù)測(cè)序原理[1]

自2015年利用純?nèi)鷾y(cè)序技術(shù)（PacBio）組裝復(fù)活草基因組[2]后（Contig N50=2.4 Mb），隨后有成功組裝出藜麥[3]等物種基因組，使得三代測(cè)序成為目前動(dòng)植物基因組denovo中常用的技術(shù)。
PacBio純?nèi)蚪M組裝案例（一）：

PacBio純?nèi)蚪M組裝案例（二）：

Nanopore三代單分子納米孔測(cè)序

Oxford公司的Nanopore測(cè)序技術(shù)借助單個(gè)分子通過(guò)納米孔時(shí)引起孔兩側(cè)電位差來(lái)實(shí)現(xiàn)信號(hào)檢測(cè)，納米孔的直徑僅允許單個(gè)核苷酸聚合物通過(guò)，而ATCG四種堿基的帶電性質(zhì)不同，因此通過(guò)電信號(hào)差異特征即可檢測(cè)出通過(guò)納米孔的堿基類(lèi)型，從而實(shí)現(xiàn)測(cè)序，目前主要測(cè)序平臺(tái)為Nanopore MinION、Nanopore GridIONx5、 Nanopore PromethION。

圖3 三代Nanopore建庫(kù)測(cè)序原理[1]

隨著近2年Nanopore三代測(cè)序平臺(tái)的興起，因其便攜性，測(cè)序成本低，測(cè)序讀長(zhǎng)長(zhǎng)，數(shù)據(jù)產(chǎn)出多等優(yōu)點(diǎn)，所以成為后續(xù)取代PacBio平臺(tái)的常用平臺(tái)，尤其可以在低成本，高質(zhì)量的前提下，完成對(duì)大基因組物種基因組的破譯，因此成為了三代基因組組裝測(cè)序的常用利器，同時(shí)自2017年至今，已發(fā)表了小丑魚(yú)[4]，野生番茄[5]等多篇基因組文章。

Nanopore三代基因組組裝案例（一）：

Nanopore三代基因組組裝案例（二）：

 

圖4 三代測(cè)序平臺(tái)PacBio和ONT測(cè)序平臺(tái)的比較[1]

百邁客三代基因組denovo測(cè)序平臺(tái)

百邁客生物科技分別于2015年引進(jìn)Pacbio測(cè)序平臺(tái)，2017年引進(jìn)Nanopore測(cè)序平臺(tái)，成為國(guó)內(nèi)基因組denovo測(cè)序服務(wù)公司之一，公司成立9年至今，在動(dòng)植物基因組denovo中積累了豐富的項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)，具有多篇Nature級(jí)別文章發(fā)表，成為國(guó)內(nèi)基因組測(cè)序服務(wù)公司之一。

PacBio測(cè)序平臺(tái)

Nanopore測(cè)序平臺(tái)

參考文獻(xiàn)：

（1）Erwin L D, Yan J, Delphine N, The ThirdRevolution in Sequencing Technology. Trends in Genetics（2018）.（2）VanBuren R, Bryant D, Edger PP., et al. Single-molecule sequencing ofthe desiccation-tolerant grass Oropetium thomaeum.Nature（2015）.
（3）Jarvis DE, Ho YS, Lightfoot DJ, et al.The genome of Chenopodium quinoa [J].Nature（2017）.
（4）Mun H T, Christopher M A, Michael P H.,et al. Finding Nemo: hybrid assembly with Oxford Nanopore and Illumina readsgreatly improves the clownfish (Amphiprion ocellaris) genome assembly. GiGaScience (2017).
（5）Maximilian S, Alexander V, Alisandra K,et al. De Novo Assembly of a New Solanum pennelliiAccession UsingNanopore Sequencing. The Plant Cell（2017）.

 

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