代謝組學(xué)是目前用于作物改良的新興技術(shù)之一。它使人們對復(fù)雜的生物過程網(wǎng)絡(luò)有了一個全面的理解，這無疑有助于理解生物過程的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，可持續(xù)加快作物生產(chǎn)。代謝組學(xué)優(yōu)勢包括能夠研究整個代謝物譜的變化，了解不同代謝物的作用和調(diào)節(jié)，從而導(dǎo)致增產(chǎn)、非生物和生物脅迫耐性、抗病性、種子組成和風味豐富。

代謝物的改變同時也影響個體表型的變化，因此，代謝物可以當做一種“微觀”表型，并利用大量的分子標記對其進行QTL定位，我們稱之為mQTL（metabolome Quantitative Trait Locus，代謝數(shù)量性狀基因座）。

mQTL目前多應(yīng)用于擬南芥、水稻、小麥、番茄[1-4]等蔬菜作物，近期圖譜君在碼文獻的時候發(fā)現(xiàn)一篇今年剛發(fā)表的多年生草本果樹mQTL案例，馬上就想跟大家分享一下，主要內(nèi)容就是利用草莓種內(nèi)構(gòu)建F1群體結(jié)合初級代謝產(chǎn)物以及品質(zhì)性狀的表型進行QTL和mQTL共定位，找到糖、酸和Vc候選基因。

 

研究背景

草莓是世界上最重要的軟果作物之一，其品質(zhì)在很大程度上取決于果實的成熟過程。在果實發(fā)育過程中，花托在生長素的的刺激下經(jīng)歷了分裂、膨脹和成熟階段，從而積累了糖、有機酸和揮發(fā)物。因此，成熟草莓因其獨特風味而受到高度重視，同時其也是糖、礦物質(zhì)、維生素和抗氧化化合物的重要來源。

提高果實營養(yǎng)品質(zhì)和感官品質(zhì)是目前草莓育種計劃的一個重要目標，本研究利用F1群體研究草莓果實初級代謝相關(guān)代謝性狀的變異和遺傳控制。

材料與方法

材料：八倍體草莓，“232”和“1392”進行種內(nèi)雜交得到F1群體，每個親本或F1分別種植6株（營養(yǎng)繁殖）

性狀：2年表型（2013和2014年），初級代謝產(chǎn)物、維生素（L-AA）和關(guān)鍵果實品質(zhì)性狀（可溶性固形物SSC、可滴定酸TA以及PH）

表型測量：2013和2014年連續(xù)在春/秋中旬中同一天收獲熟果，每行收20-25個完全成熟的果實并混成3次生物學(xué)重復(fù)，用GC-MS檢測和半定量初級代謝產(chǎn)物

標記開發(fā)：DArT 測序開發(fā)的SNP和SSR標記，參考基因組為F. vesca v4.0.a1

圖譜構(gòu)建及QTL定位：JoinMap 4.1和MapQTL 5.0的rMQM算法

表達分析：qRT-PCR（2個親本及10個子代）和RNA-seq（分別混合8個LAA高的個體和8個LAA低的個體，三次生物學(xué)重復(fù)）

代謝分析：雙親及F1群體果實中相對代謝物含量

結(jié)果與分析

1、表型分析

雖然利用Shapiro–Wilk 測驗，所有代謝產(chǎn)物的表型分布并不都是正態(tài)分布，但是其在子代群體均呈現(xiàn)連續(xù)變異，表明其為數(shù)量性狀。

2、代謝分析

對2013和2014年的層序聚類分析，發(fā)現(xiàn)F1群體變異范圍超過雙親，且分為近似相等的3大類，分別為糖及糖衍生物（A類）、氨基酸（B類）和多種化合物（C類）。并將2年的代謝數(shù)據(jù)進行了相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)2年中2個季節(jié)的極顯著相關(guān)（P<0.05）

圖1、代謝分析結(jié)果

3、mQTL定位

得到含有2089個標記，33條連鎖群的遺傳圖譜，總長為2489 cM ，平均圖距為1.34cM，其中33條連鎖群對應(yīng)草莓基因組的28條染色體。利用2007、2008和2009年的果實品質(zhì)性狀（SSC、L-AA和TA和PH）和2年代謝表型均值進行QTL定位和mQTL定位。47個性狀定位到133個獨有的QTL位點。

圖2 QTL和mQTL定位結(jié)果

4、聯(lián)合分析

糖相關(guān)QTL和mQTL結(jié)果聯(lián)合分析，在LG V的13-26cM內(nèi)找到同時控制蔗糖和棉子糖的位點（qSuc-V-4和 qRaf-V-4），位于草莓基因組chr5的1,822,882–7,927,246 bp，含有1097個基因。通過注釋發(fā)現(xiàn)，12個與糖的生物合成、代謝或運輸相關(guān)的基因。根據(jù)前人研究結(jié)果，選定7個基因用于qRT-PCR分析。qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)FvH4_5g03890基因表現(xiàn)出顯著差異。

酸相關(guān)QTL和mQTL結(jié)果聯(lián)合分析，在LG V的18.18-25.6cM內(nèi)找到控制琥珀酸的QTL位點（qSa-V-4），通過注釋找到FvH4_5g09730基因，但其表達無差異。但由于與糖定位結(jié)果存在交集，有可能是一因多效。

圖3 表達分析結(jié)果

5、L-AA候選基因Mannose-6-P-isomerase

通過本實驗之前的研究定位結(jié)果和mQTL定位結(jié)果聯(lián)合，在LG V的38.6-48.8 cM上找到一個與L-AA相關(guān)的QTL位點qLAA-V-1，位于chr5的8,160,286-13,129,181 bp，含有732個基因，通過注釋找到2個相關(guān)基因FvH4_5g20650和FvH4_5g21090（Mannose-6-P-isomerase）。利用F1的2個混樣RNA結(jié)果驗證FvH4_5g21090（FaM6PI1）為候選基因，并利用qRT-PCR驗證進行了驗證。

圖4 表達分析結(jié)果

總結(jié)

本文利用F1群體構(gòu)建遺傳圖譜，對50種初級代謝產(chǎn)物及主要果實品質(zhì)性進行QTL和mQTL定位，聯(lián)合分析分別鎖定與控制糖、酸和L-AA相關(guān)的候選基因，然后利用RNA-seq和qRT-PCR進行候選基因的驗證。其實看起來也比較簡單，但是勝在表型的多樣化及多年數(shù)據(jù)，其實存在困難的地方在于群體的代謝物測量，還有可測量代謝物的種類，有些物質(zhì)的標準品還是很難弄到的，本文只測量了初級代謝物，如果也能測量次級代謝物那就更好了，多維度考查表型，從而揭示某一個性狀的調(diào)控機制已成為目前主流手段。

 

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參考文獻：

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5.Vallarino J G, Pott D M, Cruz-Rus E,et al. Identification of quantitative trait loci and candidate genes for primary metabolite content in strawberry fruit[J].Horticulture Research,2019,6:4?

doi: 10.1038/s41438-018-0077-3

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