上篇文章介紹了高通量測序后的實驗驗證手段，主要介紹了表達量驗證、RNA結(jié)合蛋白、亞細胞定位。本文從功能方面來對轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果進行驗證，功能方面無非就是使感興趣的基因的表達升高（功能獲得）或降低（功能缺失）看樣品表型是否有變化。基因過表達和基因沉默是研究基因功能的兩個重要手段。

功能獲得研究

功能獲得：過表達基因

構(gòu)建克隆，將目的基因連接在特定的載體（可以是慢病毒載體、腺病毒載體、質(zhì)粒）上,在載體上一般含有增強基因轉(zhuǎn)錄的promoter。將克隆導(dǎo)入表達細胞中，即轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染（如果是昆蟲表達系統(tǒng),構(gòu)建的質(zhì)粒還需要先轉(zhuǎn)座成為桿狀病毒基因組才能用于轉(zhuǎn)染）。轉(zhuǎn)染進入細胞內(nèi)的外源基因在其上游強啟動子的作用下可以直接過量表達。

功能缺失研究

功能缺失：敲除、敲減、沉默基因表達

常用的沉默基因表達方法有，RNA干擾、CCRISPR/Cas9、反義寡核苷酸、位點反轉(zhuǎn)和啟動子缺失等方法?？筛鶕?jù)感興趣RNA的亞細胞定位選擇合適的敲減方法，如RNA干擾作用只作用在胞漿（胞漿+細胞器=胞質(zhì)）內(nèi)，無法對細胞核起作用，此時siRNA或者shRNA方法可能不適用，需要用其他方式進行基因沉默。

反義寡核苷酸

反義寡核苷酸（antisense oligonucleotide）是指進行了某些化學(xué)修飾的短鏈核酸（約15-25個核苷酸組成），其堿基順序排列與特定的靶標RNA序列互補，進入細胞后可按照Watson-Crick堿基互補配對的原則與靶標序列形成雙鏈結(jié)構(gòu)。反義寡核苷酸與靶標RNA結(jié)合后可抑制靶標RNA的表達。

RNAi

RNA干擾(RNA interference，RNAi)是指，將與mRNA對應(yīng)的正義RNA和反義RNA組成的雙鏈RNA(double stranded RNA, dsRNA，與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA)導(dǎo)入細胞，可以使mRNA發(fā)生特異性的降解，導(dǎo)致其相應(yīng)的基因沉默的現(xiàn)象。這種轉(zhuǎn)錄后基因沉默機制(post-transcriptional gene silencing, PTGS)被稱為RNAi。

RNAi的實現(xiàn)有兩種方式，一種是直接購買siRNA寡核苷酸片段，轉(zhuǎn)染到靶細胞中；另一種是利用shRNA慢病毒載體構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)的細胞系，shRNA在細胞中被加工為siRNA，進而發(fā)揮RNAi的作用。

CRISPR/Cas9

CCRISPR/Cas9是一種由RNA指導(dǎo)的，利用Cas9核酸酶對靶向基因進行編輯的技術(shù)。該技術(shù)可方便快捷對任意基因進行編輯改造，比如基因敲除，敲入，定點突變等，不過卻有相當(dāng)?shù)拿摪懈怕?/p>

從哪些方面可以看到基因表達的變化對表型造成變化呢，一般都是由淺入深，由細胞模型到動物模型！有了這種驗證，想發(fā)低分文章都不能夠！

細胞實驗

通過改變該基因在細胞內(nèi)的表達，來探討細胞表型是否會發(fā)生改變。如細胞增殖、細胞凋亡、細胞周期、遷移侵襲、細胞粘度、耐藥，還有難一點的血管形成、能量代謝等。

細胞表型的改變通常進行正反兩種實驗，如敲除某基因驗證細胞凋亡時，做TUNEL實驗驗證其凋亡后，還需Rescue實驗將敲除基因重新導(dǎo)入細胞看是否能挽救表型。

細胞增殖

CCK-8/CFSE流式法、克隆形成實驗、MTT檢測細胞增殖

細胞凋亡

流式細胞術(shù)、Tunel法、Annexin V/PI雙染法，以及細胞凋亡形態(tài)學(xué)檢測（光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學(xué)改變，熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡觀察細胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變）

細胞遷移和侵襲

Transwell

如果用matrigel膠包被transwell小室可以檢測腫瘤細胞的侵襲能力（invasion）；反之，不包被transwell小室檢測腫瘤細胞的遷移能力（migration）。

是不是看不懂，沒事，多看看文獻，做的時候自然就懂啦……

 

動物實驗

通過改變關(guān)注基因在動物內(nèi)的表達，來探討動物的表型是否會發(fā)生改變。因此，構(gòu)建模擬人類疾病表型的動物模型至關(guān)重要。

醫(yī)學(xué)動物模型

• 誘發(fā)性動物疾病模型

  人為地誘發(fā)動物產(chǎn)生類似人類疾病模型

• 自發(fā)性動物模型

  不加任何人工誘發(fā)，自然條件下自然產(chǎn)生疾病的動物。

• 抗疾病型動物模型

  即特定的疾病不會在某種動物發(fā)生，可研究天然抗性的因素。

• 生物醫(yī)學(xué)動物模型

  動物正常的生物學(xué)特征來提供人類疾病相似表型的疾病模型。

常見腫瘤模型

• 自發(fā)瘤模型

  未經(jīng)任何有意識的人工處理，自然形成腫瘤

• 誘發(fā)瘤模型

  利用外源性致癌物引起細胞遺傳特性改變，從而出現(xiàn)異常生長活性細胞，形成腫瘤。常用實驗動物為大鼠，也有用小鼠、豚鼠、兔、犬等。

• 移植瘤模型

  將動物或人體腫瘤細胞/組織移植到動物體內(nèi)連續(xù)傳代而形成腫瘤。腫瘤研究中最常用的是裸鼠模型，即建立皮下移植瘤模型（將腫瘤細胞或腫瘤組織直接種植在小鼠的皮下）。

  注：不易成瘤的腫瘤組織一般選擇腫瘤腎被膜下種植移植瘤模型

• 基因組修飾模型

  通過在動物整體敲除或插入特性的基因而建立的腫瘤模型。

采用所研究的疾病/性狀對應(yīng)的動物模型，對動物模型采用上述技術(shù)對特定基因進行過表達或沉默處理，接下來去檢測相應(yīng)的指標。如采用NB技術(shù)檢測相應(yīng)基因的表達、腫瘤相應(yīng)的生長曲線、HE檢測組織的形態(tài)變化等。

 

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