在二代測序遍地開花的時代，想發(fā)一篇高分的文章越來越難，今天，我們就來帶大家解析一篇成功案例，看看作者是如何利用普通二代轉(zhuǎn)錄組引領(lǐng)高分的~

研究背景

根在水和養(yǎng)分的獲取、維持植物地上生長中起著至關(guān)重要的作用。大多數(shù)單子葉植物和許多熱帶、溫帶濕樹林中存在天然的不定根。不定根形成的生物過程復雜多樣，按照時間階段可分為誘導、啟動、根原基激活和生長，不同階段均受到多種因素的影響，如遺傳背景、母本生理狀態(tài)、激素的應(yīng)用和環(huán)境條件等。其中影響不定根發(fā)育的最重要的因子則為植物激素，而生長素則起了決定性作用。近年來，在擬南芥上的生長素對不定根的調(diào)控已經(jīng)取得了巨大的科研成果，其可通過生長素信號網(wǎng)絡(luò)誘導不定根的萌發(fā)。研究表明，楊樹和擬南芥上對不定根的誘導和發(fā)育存在一定的相同點，但是將草本植物上不定根的研究成果應(yīng)用于木本植物的可行性仍需要進一步的研究。

材料方法

試驗材料：銀腺楊無性系84K（銀白楊X腺毛楊）的枝條

試驗內(nèi)容：

1、ProPagFBL1::GUS試驗；構(gòu)建過表達（OE）和干擾（KD）PagFBL1載體并轉(zhuǎn)染，培育轉(zhuǎn)基因植株，進行表型測定

2、在不定根誘導的0，12，24和48 h采集莖部樣品，進行轉(zhuǎn)錄組測序

3、雙分子熒光互補技術(shù)、酵母雙雜交實驗

測序平臺：北京百邁客生物科技有限公司?Illumina Hiseq 2500 PE125

研究結(jié)果

1、PagFBL1在不定根發(fā)育中具有時空表達差異

GUS信號在剪切后的0h主要在莖形成層和未成熟的木質(zhì)部存在，隨后在不定根誘導的2天后，越來越多的GUS信號聚集在形成層和次生韌皮部，3~4天，形成層、次生韌皮部和皮層的不定根原基細胞中出現(xiàn)GUS信號。在不定根誘導5天后，GUS信號在不斷增大的根原基逐漸降低并在第六天消失。結(jié)果表明，PagFBL1會參與不定根生成的初期階段，如誘導和萌生期，可參與生長素信號通路從而調(diào)控不定根的誘導和萌生。

圖1、不定根生成時期PagFBL1的表達模式

2、在轉(zhuǎn)基因群體里過表達和干擾PagFBL1對不定根形成的影響

相較于野生型，過表達株系（OE）更早的出現(xiàn)了不定根且在不同時間點，其有不定根的莖葉所占比例更高，生根率達到100%的時間比野生型早6h。此外，OE植株的生根量也顯著增加，且在土壤中種植5個月后，對其總根長度、根面積和根的鮮重與干重進行測定，發(fā)現(xiàn)OE植株含有更大的根系，且在使用IAA處理移植葉片后趨勢相同。在PagFBL1?KD株系，這種現(xiàn)象在使用IAA處理移植葉片后也是延遲出現(xiàn)的。此外，與OE和野生型的株系相比，KD的不定根的數(shù)量和生物量顯著下降。結(jié)果表明，PagFBL1對楊樹不定根的形成有重要作用。

圖2、過表達、干擾和野生型植株不定根生成比較

3、過表達PagFBL1刺激轉(zhuǎn)基因楊樹基因表達的重塑

使用Illumina測序技術(shù)進行轉(zhuǎn)錄組分析從而鑒定影響不定根生成的差異表達基因。不論在野生型還是過表達植株里，0h與12h的差異表達基因均多于12h vs. 24h和24h vs. 48h比較組。因此，在不定根誘導和萌發(fā)的前12h發(fā)生了大量基因的重塑。OE植株在前12h增加1518個差異表達基因，其中有119個基因在野生型的12h vs. 24h中出現(xiàn)（圖3）。這些結(jié)果表明，PagFBL1基因的高表達會增強促進不定根形成的基因的表達變化。

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圖3、差異表達基因分析

隨后，對這些差異表達的基因進行COG分析，發(fā)現(xiàn)在OE植株#18和野生型中，與其他時間點相比，在前12h，參與信號轉(zhuǎn)導的大量基因被激活。在#18植株中，前12h有大量的DEGs僅富集于植物激素信號轉(zhuǎn)導通路，其中有26.9%的差異表達基因富集到了生長素通路中（圖4）。這些基因包括：5個細胞色素P450家族成員、1個Cullin-1 (CUL1)、7個E3泛素蛋白連接酶、4個26S蛋白酶體蛋白、2個IAA28家族、3個ARFs基因和3個GH3家族。利用qRT-PCR對這些基因的表達量進行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)其表達趨勢與RNA測序得到的RPKM趨勢相似。ARF5.1，ARF5.2，GH3.1和GH3.6?在不定根的誘導中高表達，其中在OE中表現(xiàn)的更明顯。在不定根誘導中參與IAAs和ARFs的結(jié)果表明在誘導和萌發(fā)期，生長素可通過FBL1-IAA-ARF信號促進不定根的形成。

圖4、差異表達基因功能聚類分析

4、PagFBL1通過PagIAA28.1和PagIAA28.2作用生長激素信號通路

使用雙分子熒光互補技術(shù)，將15個Aux/IAA基因共轉(zhuǎn)染到煙草葉片，發(fā)現(xiàn)只有在nYFP-PagFBL1與?cCFP-PagIAA28.1?和cCFP-PagIAA.28.2共轉(zhuǎn)染后（圖5a）才會發(fā)現(xiàn)YFP熒光蛋白信號，且生長素濃度越高，信號越強，而在其他組合中，只發(fā)現(xiàn)了DAPI信號（圖5b）。

基于雙分子熒光互補研究結(jié)果，進一步進行酵母雙雜試驗。結(jié)果表明，PagFBL1和PagIAA28.1、PagIAA.28.2均有很強的結(jié)合，由此證明他們參與楊樹莖段不定根的誘導過程。

圖5、驗證試驗

亮點總結(jié)

1、好的試驗設(shè)計，是文章出彩的前提

2、故事一定要有完整性，環(huán)環(huán)相扣，由淺入深，才能吸人眼球

3、多種技術(shù)手段聯(lián)合應(yīng)用，表型數(shù)據(jù)和測序數(shù)據(jù)相輔相成，互相印證，才能讓研究更具說服力

 

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