Hi-C是2009年提出的染色體構(gòu)象捕獲結(jié)合高通量測序的一種技術（Erez Lieberman-Aiden, et al,Science），是衍生于染色體構(gòu)象捕獲技術（3C）的高通量技術，實現(xiàn)了全基因組范圍內(nèi)的染色體片段間的相互作用的捕獲檢測。作為染色體三維構(gòu)象與互作研究的利器，Hi-C技術廣泛應用于腫瘤/疾病發(fā)生發(fā)展機制、分化發(fā)育機制、畸變機制等研究。

同樣源于3C的用以研究染色體互作的技術還包括4C（“circular?3C”或“3C-on-Chip”）、5C（Chromosome?conformation?capture?carbon?copy）?、ChIA-PET（chromatin?interaction?analysis?by?paired-end?tag?sequencing）?，不同的3C衍生技術的區(qū)別在于捕獲的連接片段檢測和定量方式。

3C：經(jīng)典的3C實驗中，通過基因座特異性引物PCR檢測單個連接產(chǎn)物，大多數(shù)3C通常僅能分析幾十到幾百Kb染色質(zhì)之間的相互作用，通量低，費時費力——one?vs?one。

4C：使用反向PCR產(chǎn)生單基因座的全基因組相互作用圖，研究已知DNA片段（bait）與全基因組未知DNA片段之間的互作——one?vs?all。

5C：基于3C的基本原理，結(jié)合連接介導的擴增?（ligation-mediated?amplification，LMA）來增加3C檢測的通量，識別兩組大量位點之間并行的數(shù)百萬個相互作用，例如一組啟動子和一組遠端調(diào)控元件之間的互作——many?vs?many。

ChIA-PET：對感興趣的蛋白質(zhì)結(jié)合位點之間的遠程互作進行全基因組分析。

Hi-C：提供了一個真正全基因組范圍的相互作用圖譜（該圖譜的分辨率取決于測序的深度）——all?vs?all。

 

Hi-C之技術流程

 

Hi-C的主要原理是將空間結(jié)構(gòu)臨近的DNA片段進行交聯(lián)，并將交聯(lián)的DNA片段富集，然后進行高通量測序，對測序數(shù)據(jù)進行分析，即可揭示染色體片段間的交互信息，闡述染色體三維構(gòu)象。

（Rao S S,et al.,Cell）

Hi-C與普通二代測序（如全基因組重測序等）最大的區(qū)別在于前期建庫時對構(gòu)象的固定與捕獲，Hi-C文庫制備流程主要包括甲醛交聯(lián)、細胞裂解、內(nèi)切酶酶切、末端修復及生物素標記、片段連接、捕獲帶生物素標記的片段、文庫質(zhì)檢等步驟。Hi-C文庫質(zhì)量受多種因素影響，如細胞裂解劇烈程度、細胞裂解期間的蛋白酶抑制劑含量等，Hi-C文庫質(zhì)量直接影響后續(xù)的有效數(shù)據(jù)產(chǎn)出。

因而Hi-C技術難度較高的主要難點就在于建庫，大多數(shù)公司在建庫這一環(huán)節(jié)就已經(jīng)被排除門外，有些公司雖然能做但也可能需要多次建庫。百邁客Hi-C標準建庫流程已申請國家專利，我們致力于將Hi-C打造成類似于轉(zhuǎn)錄組一樣技術成熟的產(chǎn)品，成為功能基因研究的好幫手。

百邁客一直保持著近100%的建庫成功率，即使是次生代謝物種類較多的建庫難度大的植物，百邁客的一次建庫成功率在97%以上，不僅如此，憑借一定的技術優(yōu)勢和項目經(jīng)驗，BMK已經(jīng)幫助客戶解決了某些Hi-C“疑難雜癥”，并助力客戶的科研進展。

合格的Hi-C文庫對于提升有效數(shù)據(jù)量具有重要作用，因此有效Hi-C數(shù)據(jù)量的高低會直接反映Hi-C文庫建庫質(zhì)量的高低，主要從Valid?Interaction?Pairs含量對Hi-C數(shù)據(jù)進行評估。Invalid?Interaction?Pairs主要主要包含自連類型、末端懸掛類型等。Valid?Interaction?Pairs在30%以上即認為數(shù)據(jù)合格，根據(jù)已有項目經(jīng)驗，百邁客動物樣品文庫的有效數(shù)據(jù)最高達86.68%。

Hi-C之研究內(nèi)容

 

通過Hi-C技術可以獲得全基因組范圍內(nèi)的互作信息，得到染色體三個層級的三維結(jié)構(gòu)：A/B?compartment、拓撲相關結(jié)構(gòu)域（TAD）、染色質(zhì)環(huán)（loop）。

A/B?compartment

染色質(zhì)劃分為A、B兩種compartments：

A?compartments：常染色質(zhì)，松散染色質(zhì)狀態(tài)、高基因密度、轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)域，富集轉(zhuǎn)錄活性相關的表觀遺傳標記（例如H3K4me3）。

B?compartments：異染色質(zhì)，壓縮染色質(zhì)狀態(tài)、低基因密度區(qū)域、轉(zhuǎn)錄抑制區(qū)域，富集無轉(zhuǎn)錄活性的表觀遺傳標記（例如H3K27me3）。

A/B?compartments具有組織、時期、狀態(tài)特異性，在不同組織或不同時期或疾病狀態(tài)間能夠發(fā)生轉(zhuǎn)換，這種轉(zhuǎn)換和基因表達調(diào)控有一定關系。當染色體上某區(qū)域發(fā)生A/B?compartment轉(zhuǎn)化，會影響其中的基因的轉(zhuǎn)錄活性，通常B?compartment轉(zhuǎn)換為A?compartment的區(qū)域相關基因大多表達上調(diào)，而A?compartment轉(zhuǎn)換為B?compartment的區(qū)域相關基因則下調(diào)。

腫瘤細胞系與正常細胞系間A/B?compartment轉(zhuǎn)換(Pengze Wu1,et al,NC)

拓撲相關結(jié)構(gòu)域（TAD）

拓撲相關結(jié)構(gòu)域(topologically?associating?domains，TAD)是一段具有折疊結(jié)構(gòu)的DNA序列，此區(qū)域內(nèi)部的互作頻率會顯著高于毗鄰的兩個區(qū)域之間的互作頻率，TAD是基因組在空間結(jié)構(gòu)中的基本組織形式。TAD結(jié)構(gòu)在不同時空下（組織、發(fā)育階段、狀態(tài)等）具有一定的保守性，同時也有一些動態(tài)變化。

TAD邊界有明顯的界限，通常存在大量的絕緣子、管家基因等，其內(nèi)部是一個獨立的調(diào)控單元，內(nèi)部的基因存在協(xié)同表達特征；TAD邊界具有很有很重要作用，將邊界部分刪除后會使得基因調(diào)控變得紊亂，導致原來沉默的基因被轉(zhuǎn)錄，而原來應該轉(zhuǎn)錄的則沉默了。

腫瘤細胞系與正常細胞系的TAD(Pengze Wu1,et al,NC)

染色質(zhì)環(huán)（loop）

DNA在CTCF等蛋白質(zhì)的介導下形成遠距離互作，這種結(jié)構(gòu)通常稱為loop結(jié)構(gòu)。通過Hi-C可以檢測到線性距離很遠而空間距離被拉至很近的DNA片段，即peak位點，它們之間的交互頻率往往高于線性上相鄰的片段，以peak位點來確定loop位置。

同樣loop結(jié)構(gòu)在不同時空下（組織、發(fā)育階段、狀態(tài)等）會有一些動態(tài)變化，且通過loop錨定的位點中包含啟動子、增強子、沉默子等，當發(fā)生loop結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化，如新形成或消失，在一定程度上會影響基因的調(diào)控。

loop與基因轉(zhuǎn)錄開/關（Rao S S,et al.,Cell,2014）

 

 

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