2021年8月，百邁客和中國醫(yī)科大學合作文章“Identification of Target PTEN-Based miR-425 and miR-576 as Potential Diagnostic and Immunotherapeutic Biomarkers of Colorectal Cancer With Liver Metastasis”發(fā)表于期刊Frontiers in Oncology（IF：6.244）。其中轉錄組數據差異及功能分析等使用百邁客云平臺完成，此外百邁客業(yè)務還包括單細胞轉錄組、空間轉錄組、單細胞ATAC&GEX、單細胞免疫組庫等等，有興趣的老師可以聯系當地銷售。

結直腸癌（CRC）是最常見和致命的癌癥之一，其主要并發(fā)癥是繼發(fā)性肝轉移。這種患者臨床應用的生物標志物非常少導致該病仍無法治愈。近年來越來越多的研究表明，腫瘤的發(fā)生和發(fā)展與免疫逃逸密切相關，提示免疫相關指標在結直腸癌肝轉移（CRLM）中的作用過去可能被忽視。作者揭示了升高的miR-425和miR-576通過抑制PTEN介導的細胞免疫功能促進CRLM?；贕SE81581和GSE44121數據集，相比于原發(fā)性CRC組織miR-425和miR-576在CRLM中顯著上調。此外，作者還確定了兩個miRNA參與抑制腫瘤轉移相關的P53和TGF-β信號通路，均縮短了轉移易感性患者的總生存期。值得注意的是對配對的CRC組織進行原位雜交，不僅證實了miR-425和miR-576的表達在CRLM中顯著上調，而且還揭示了它們與腫瘤惡化尤其是肝轉移密切相關。此外，作者進一步證實了miR-425和miR-576聯合使用是一種有效的肝轉移和不良臨床結局的模型。機制方面，PTEN下調被證實是miR-425和miR-576作為肝轉移相關癌基因的共同靶點，由于在CRLM中存在結合位點和協調抑制P53/TGF-β信號通路，通過分子學實驗在CRC細胞中進一步證實。重要的是靶蛋白PTEN與微衛(wèi)星不穩(wěn)定性、腫瘤微環(huán)境和免疫細胞浸潤密切相關。因此，作者推測miR-425和miR-576是CRLM預防和免疫治療的新生物標志物，也是PTEN-P53/TGF-β功能軸的上游抑制劑。

英文題目：Identification of Target PTEN-Based miR-425 and miR-576 as Potential Diagnostic and Immunotherapeutic Biomarkers of Colorectal Cancer With Liver Metastasis

中 文 題 目：基于靶蛋白PTEN的miR-425和miR-576作為大腸癌肝轉移的潛在診斷和免疫治療標志物的鑒定

期 刊：Frontiers in Oncology

IF：6.244

發(fā)表時間：2021.8

合作單位：中國醫(yī)科大學

研究背景

結直腸癌是西方第三大常見癌癥也是全球主要的死亡原因。超過一半的低腫瘤淋巴結轉移（TNM）的CRC患者在診斷時通常在3年內發(fā)生轉移，這表明迫切需要有效的生物標志物來評估易感性。近年來，研究CRLM的靶點特別是miRNAs的研究并不缺乏，但能應用于臨床實踐的靶點很少，包括免疫治療，這是一種新興的癌癥治療策略。10號染色體上缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物（PTEN）是一種腫瘤抑制因子，與許多癌癥的惡性進展密切相關如CRLM。值得注意的是近期一項研究發(fā)現，miR-25-3p、miR-130b-3p和miR-425-5p共同靶向PTEN，從而促進CRLM的發(fā)生。然而，很少有人關注miR-576-3p與PTEN之間的調控關系。

材料方法

試驗材料：157例CRC患者癌組織和癌旁組織，其中29例為繼發(fā)性肝轉移患者。

試驗方法：TCGA和GEO數據庫中的RNA-seq數據、TMA和ISH試驗、細胞轉染試驗、qPCR、WB等。

研究結果

1、高水平的miR-425和miR-576與CRLM相關

為了探索促進CRLM進展的重要miRNA，作者分析了來自GSE81581 （n = 8）隊列的數據，揭示了CRLM與原發(fā)性結直腸癌組織之間的miRNA失調，其中207個miRNA上調，20個miRNA下調（圖1A）。MiRNA-425和miRNA-576在CRLM中顯著上調（圖1B）。此外，作者研究了miRNA-425和miRNA-576共同發(fā)揮的轉移相關作用，通過KEGG分析發(fā)現P53和TGF-β信號通路顯著富集（圖1C）。值得注意的是，miR-425和miR-576的高表達縮短了CD4+或II期直腸腺癌（READ）患者的總生存時間，這兩者都與CRC轉移密切相關（圖1D）。
為了驗證這兩種miRNA的差異表達，作者收集了157例CRC患者癌組織及癌旁組織。TMA和ISH試驗顯示，與對照相比miR-425和miR-576在CRC患者中高表達尤其是肝轉移患者（圖1E和F）。ROC曲線計算miR-425和miR-576基于肝轉移及其他相關危險因素線下面積，初步確定其在CRLM中的可信診斷能力（圖1G）。

圖1高水平的miR-425和miR-576與CRLM相關

2、miR-425和miR-576表達與CRLM相關臨床變量的相關性

為了探討miR-425和miR-576在CRLM患者中的臨床價值，作者分析了miR-425和miR-576與環(huán)境因素或病理變量包括年齡、性別、家族史、T分期、樣本量、腸道占位、分化、血管浸潤、原發(fā)部位和肝轉移。頻率分布和校正后的回歸分析顯示，miR-425和miR-576高表達均在肝轉移患者組織中頻繁分布（圖2A）。此外，miR-425過表達與CRC患者晚期T期、腸道占位、分化程度和原發(fā)性直腸相關（圖2B）。增加miRNA的表達是滲透到漿膜和廣泛占用腸道的一個促進因素（圖2C）。
MDR分析顯示，miR-425、miR-576與家族病史、分化程度、原發(fā)部位聯合使用是評估肝轉移風險的最佳預測模型，其交叉驗證一致性（CVC）最高，預測誤差最小（表1）。這些結果提示miR-425和miR-576高水平的CRC患者特別容易發(fā)生肝轉移。

圖2 miR-425和miR-576表達與CRLM相關臨床變量的相關性

3、miR-425、miR-576表達對CRLM患者預后的影響

總之，系統生存分析顯示，miR-425高表達的患者總生存期和無病生存期較差，miR-576高表達的患者也是如此（圖3A）。結果首先證明miR-425和miR-576高表達與肝轉移患者的OS和DFS關系更為顯著（圖3B）。如預期，由miR-425和miR-576組成的雙因素模型可以有效預測OS狀態(tài)（表2），而miR-425和miR-576的T分期和分化程度是評估DFS風險的最佳模型（表3）。重要的是，通過計算風險評分，作者進一步驗證了miR-425和miR-576的組合在晚期CRC和CRLM中是一個較好的預后預測因子具有較高的敏感性（圖3C-H）。這些結果表明，高水平的雙miRNA標記常常預示著CRC的預后不良尤其是CRLM。

圖3 miR-425和miR-576對結直腸癌肝轉移患者預后的影響

4、PTEN被鑒定為促進CRLM的miR-425和miR-576的靶點

為了闡明miR-425和miR-576介導肝轉移和不良預后的有意義的下游靶點，作者在GSE81558 （n = 6）數據集上繪制火山圖，分析CRC組織和癌旁組織之間的DEGs（圖4A）。PTEN是CRLM中顯著下調基因與miR-425和miR-576靶基因的交集（圖4B）。聚類熱圖顯示在CRLM中PTEN的下調最顯著（圖4C）。進一步檢索STRING發(fā)現與PTEN互作的關鍵蛋白（圖4D）。配對序列間的有效MFEs分別為?20.8和?16.1 kcal/mol（圖4E）。進一步分析發(fā)現，基于TCGA數據庫PTEN在幾種類型的腫瘤中表達顯著下調（圖4F），PTEN表達越低易發(fā)生腫瘤轉移且預后越差（圖4G和H）。此外，基于GSE62321 （n = 26）數據集，PTEN與miR-425和miR-576一致，證實PTEN正向參與P53、TGF-β信號通路，在腫瘤轉移中發(fā)揮有意義的作用（圖4I）。這些結果表明，PTEN下調是CRLM中miR-425和miR-576的共同靶點，導致臨床結果不佳。

圖4 PTEN被鑒定為促進CRLM的miR-425和miR-576的靶點

5、miR-425和miR-576通過抑制PTEN-P53/TGF-b軸對CRC細胞腫瘤轉移的影響

接下來，作者證明了miR-425和miR-576通過負調控PTEN-P53/TGF-β軸，在細胞學水平上通過敲低和過表達功能實驗確定了其誘導CRC轉移的發(fā)生。QPCR檢測發(fā)現，在HCT116和SW480細胞系中，這兩種miRNA的過表達均導致PTEN mRNA表達明顯抑制（圖5A）。MiR-425和miR-576的缺失顯著增強了PTEN mRNA的表達（圖5B）。WB試驗證實PTEN蛋白的變化一致，P53和TGF-β也是如此（圖5C和D）。正如預期的那樣，結果顯示miR-425和miR-576顯著抑制WT熒光素酶基因表達強度，然而在Mut基因上沒有觀察到明顯的變化表明PTEN 3’UTR與miR-425和miR-576之間存在直接的結合模式（圖5E）。此外miR-425和miR-576的高表達顯著促進了HCT116和SW480細胞的遷移能力分，反之亦然（圖5F-I）。綜上所述，miR-425和miR-576直接靶向PTEN介導的P53/TGF-β信號通路，參與了CRLM過程中細胞遷移的促進。

圖5 miR-425和miR-576通過抑制PTEN-P53/TGF-β軸對CRC細胞腫瘤轉移的影響

6、CRLM中miR-425/miR-576-PTEN軸的免疫分析

為了進一步研究miR-425和miR-576在CRLM發(fā)生和發(fā)育的免疫調節(jié)中的重要作用，作者首先分析了miR-425和miR-576與相關指標的相關性。因此，miR-425在CRC進展中與免疫檢測點密切相關，如CD160、CD200R1和CD80及免疫通路包括CD65自然殺傷細胞和單核細胞（圖6A）。MiR-425與檢測點和通路存在顯著相關性（圖6B）。此外，作者進一步發(fā)現腫瘤抑制因子PTEN與MSI、TME、免疫細胞浸潤呈正相關，從免疫的角度闡明了PTEN對CRLM的調控作用（圖6C-E）。以上結果表明，miR-425/ miR-576介導的PTEN抑制通過觸發(fā)免疫逃逸促進CRLM過程。

圖6 miR-425/miR-576和PTEN對CRLM的免疫分析

 

研究結論

綜上所述，miR-425和miR-576的升高與腫瘤發(fā)生和更壞的結果有關，并負向參與了CRLM中PTEN-P53/ TGF-β免疫功能軸。因此，作者的工作有助于更好地了解miRNA-mRNA的潛在應用，為在CRLM預防和免疫治療中尋找潛在的生物標志物和靶點提供即時線索。