Nanopore三代測序是一種單分子實時電信號測序技術，又稱為Isoform Sequencing（Iso-Seq），無需打斷，可直接讀取從5’端到3’端polyA尾的高質量單個RNA分子全長序列。2018年，北京百邁客與牛津納米孔公司（Oxford Nanopore Technologies，簡稱ONT）達成長期合作，基于ONT測序平臺進行產品開發(fā)與應用。目前，百邁客擁有MinION、GridION X5和PromethION三種型號全套納米孔測序儀。相比于二代RNA-Seq測序技術，ONT三代測序無/低GC含量偏好性，多比對效率低，可準確識別可變剪接（AS），可選擇性多聚腺苷酸化（APA），基因家族，融合基因，lncRNA及其靶基因，而且可同時對基因和轉錄本進行定量分析。

基于Nanopore測序平臺的優(yōu)勢，ONT全長轉錄組越來越受到廣大研究者的青睞，大家也越來越關注全長轉錄組研究應用方向，以及如何充分利用ONT測序數據，發(fā)表高分高質量文章。相較于農學科研研究，ONT全長轉錄組在醫(yī)學研究方向日漸成熟，在各類疾病，如肺癌，白血病，精神病，腎病，乳腺癌等都有文章發(fā)表。今天小編跟大家分享一下ONT全長轉錄組應用方向和農學經典案例！

ONT全長轉錄組經典應用方向：

1. 完善基因組注釋：由于ONT測序鑒定出新基因，新的isoforms，在完善基因組注釋方面獲得關注。

2. 基因結構的研究：可變剪接、APA、融合基因、基因家族、lncRNA及其靶基因預測。

1) 可變剪接事件的發(fā)生，使一個基因產生多個不同的mRNA轉錄本，進而能夠翻譯成多種不同的蛋白。可變剪切是調節(jié)基因表達和產生蛋白質多樣性的重要原因，是轉錄后水平調節(jié)基因表達的重要機制之一。它在在動物的生長發(fā)育、細胞分化、細胞功能等方面具有重要作用。

2) APA是指一個基因上有多個多聚腺苷酸化位點，從而使得一個基因可以產生多條帶有不同長度3’UTR的mRNA，或產生不同編碼序列的轉錄本，APA增加了轉錄組的復雜性。APA影響胚胎發(fā)育、細胞分化、細胞增殖、神經元活性、免疫應答、腫瘤形成與轉移等生物學過程。

3) 融合基因指兩個個或多個基因的編碼區(qū)首尾相連，置于同一套調控序列 (包括啟動子、增強子、核糖體結合序列、終止子等) 控制之下構成的嵌合基因，由染色體重排產生，包括染色體易位、缺失、插入、顛倒等。研究表明，許多疾病、癌癥與融合基因的發(fā)生相關。

4) 真核生物轉錄組中存在大量長非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA），這些lncRNA可能在基因表達調控中起關鍵性作用。挖掘lncRNA的序列、結構、表達及功能信息是研究生物學問題必不可少的部分。

3. 基因功能研究：通過傳統(tǒng)Race獲得整個轉錄本全長，實驗經費、時間成本高，而通過三代測序可獲得全長，無需RACE實驗。

4. 轉錄本定量：ONT全長轉錄組可同時對基因和轉錄本進行定量，不需要二代數據輔助。而一些已知關鍵基因探索新功能，基因發(fā)生變異變化的是不同的轉錄本，不是整個基因的變化。而在進行差異基因研究時，基因表達沒有差異，轉錄本定量可能會出現(xiàn)差異。

經典案例解讀

成功案例一

英文題目：Comparative Analyses of Full-Length Transcriptomes Reveal Gnetum luofuense Stem Developmental Dynamics

中文題目：全長轉錄組的比較分析揭示了羅浮買麻藤莖的發(fā)育動力學

發(fā)表期刊：Frontiers in genetics

影響因子：4.599

原文鏈接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8027257/

主要實驗方法和材料

材料：GLN01（莖尖，直徑=0.5-2mm）、GLN02（2-3 mm）、GLN03（3-4 mm）和GLN04（4-5 mm）。每個發(fā)育階段制備了三個重復樣品（兩個來自雌性個體，一個來自雄性個體）

測序平臺：MinION，共構建12個轉錄組文庫。

主要研究結果與分析

1. AS和APA分析

在12個羅浮買麻藤莖樣本中檢測到總共24151個AS事件（圖2A）。其中，內含子保留所占比例最大（7.793個事件；33.23%），而可變外顯子所占比例最?。?19個事件；1.32%）。內含子保留數在GLN02期和GLN04期之間顯著增加（圖2B）?？勺?’剪接位點在GLN03和GLN04之間顯著增加，而可變3’剪接位點和外顯子跳躍僅在GLN03中顯著增加（p值<0.05）。APA分析結果顯示，3’末端有5個多聚腺苷酸化位點的轉錄本所占比例最大（57194；42.56%），其次是只有一個位點（18948；14.02%）或兩個位點（16189；12.05%）的位點（圖2C）。APA事件的數量在整個買麻藤莖發(fā)育過程中也沒有顯著差異（圖2D）。在3’UTR上游50nt位置檢測到尿嘧啶（U）的富集，而在下游50 nt位置發(fā)現(xiàn)腺嘌呤（A）的富集，這表明所有poly(A)位點存在核苷酸偏倚（圖2E）。在所有轉錄本中，在poly（A）位點上游50 nt位置也檢測到三個保守基序（即AAAUGC、CCAUGC和CCAUCC）（圖2F）。

圖2 AS和APA事件的鑒定

2. CDS and lncRNAs分析

總共鑒定了38108個ORF，包括30323個（79.57%）完整的ORF，它們同時具有起始密碼子和終止密碼子。就完整的ORF而言，100-200 bp（12855個ORF）、0-100 bp（12150個）和200-300 bp（3751個）長度所占比例最大（圖3A）。共鑒定出728個lncRNAs，平均長度在298到4362 nt之間。這些lncRNAs進一步分類為545個基因間區(qū)lncRNAs（74.86%）、28個反義lncRNAs（3.85%）、13個內含子lncRNAs（1.79%）和142個正義lncRNAs（19.50%）（圖3C）。研究還發(fā)現(xiàn)，這些lncRNAs調控的順式靶基因比那些反式靶基因多（圖3D）。發(fā)現(xiàn)在GLN01和GLN03之間（Student t檢驗，p=0.002），以及GLN01和GLN04之間（p=0.037），這些lncRNAs調控的順式靶基因顯著增加，而這些lncRNAs調控的反式靶基因在整個莖發(fā)育過程中未發(fā)現(xiàn)顯著變化。

圖3基于12個全長轉錄組的ORF和lncRNAs鑒定

3. TF and WGCNA Analyses

共鑒定出4251個TFs，屬于208個基因家族。其中最豐富的是AP2/ERF（176）、MYB相關（135）和bHLH（133）（圖4A），同時WGCNA分析也確定了與羅浮買麻藤莖發(fā)育高度相關的八個TFs模塊（圖4B、C）。綠松石色（編號1，315 TFs）、黑色（編號2，215 TFs）和黃色（編號7，75 TFs）最富集。綠松石色模塊中的TF主要在GLN01中表達，而黑色和黃色模塊中的TF分別在GLN02和GLN04中密集表達（圖4B、C）。很明顯，綠松石色模塊中的TFs主要通過三種KEGG途徑富集，“淀粉和蔗糖代謝”（11 TFs，ko00500）、“淀粉和蔗糖代謝”（8 TFs，ko00500）和“戊糖和葡萄糖醛酸鹽相互轉化”（6 TFs，ko00040）（圖4D）。類似地，黑色模塊中的TFs主要富集于“植物-病原體相互作用”（6 TFs，ko04626）、“碳代謝”（4TFs）和“苯丙烷生物合成”（4 TFs，ko00940），而黃色模塊中的TFs主要富集于“氰基氨基酸代謝”（2 TFs，ko00460）和“糖酵解/糖異生”（2 TFs，ko00010）。此外，還發(fā)現(xiàn)綠松石色模塊中bHLH、GRF和MYB相關蛋白高度表達；在黑色模塊中EGAP2/ERF、NAC和MYB高度表達；在黃色模塊中MYB、bZIP和PLATZ高度表達（圖4E）。

圖4 TFs的鑒定和WGCNA分析

4. DET s and K-Means Clustering

結果顯示GLN01和GLN04之間有492個DET，其中283個上調，209個下調（圖5A）。接著是GLN01和GLN02，GLN01和GLN03，分別有468個和136個。富集分析結果顯示，GLN01和GLN04之間的DET在三條KEGG途徑：“苯丙烷生物合成”（16個DET）、“淀粉和蔗糖代謝”（10個DET）和“氰基氨基酸代謝”（8個DET）中顯著富集（圖5C）。

然后，使用K-均值聚類算法將所有DET分為七類（圖5D）。結果表明，來自K7簇的轉錄物主要表達在頂端（GLN01），而其余簇，K3和K4，主要表達在GLN02和GLN04之間。這七個簇的轉錄本在多個GO術語中富集（圖5E），例如，K7簇轉錄物在“細胞壁生物發(fā)生”、“植物型細胞壁組織”和“細胞壁”術語中富集，來自K3簇的轉錄物在“調控莖尖分生組織發(fā)育”、“調控葉片發(fā)育”和“對內源刺激的反應”術語中富集，而來自K4簇的轉錄物在“氮化合物轉運”、“脈管發(fā)育”和“光系統(tǒng)I”富集。

圖5 DET-s和DET-s的K-均值聚類分析

5. 總結

在羅浮買麻藤莖的12個全長轉錄組中預測有24151個AS事件、134391個APA事件和728個lncRNAs。WGCNA和K-means聚類分析表明，關鍵轉錄因子與一系列KEGG途徑有關，包括光合作用、氮運輸和葉片個體發(fā)育。這些發(fā)現(xiàn)為與羅浮買麻藤相關的纖維和造紙工業(yè)提供了有價值的信息，并闡明了納米孔測序技術在裸子植物全長轉錄組研究中的應用。

成功案例二

英文題目：Nanopore long-read RNAseq reveals regulatory mechanisms of thermally variable reef environments promoting heat tolerance of scleractinian coral Pocillopora damicornis

中文題目：ONT全長轉錄組揭示熱變化的珊瑚礁環(huán)境中促進鹿角珊瑚耐熱性的調節(jié)機制

發(fā)表期刊：Environmental research

影響因子：6.498

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33503412/

主要實驗方法與材料

材料：位于中國海南三亞灣鹿回頭邊緣礁石頭，高溫淺水區(qū)HP和氣溫深水區(qū)LP組中，每十個樣本中有兩個以等摩爾量混合以制備新樣本，以覆蓋更多樣本，即每組使用五個生物重復。

建庫測序：PromethION平臺，共構建了10個轉錄組文庫（HP組的Q1-Q5和LP組的S1-S5）。

主要實驗結果與分析

1. APA和AS鑒定

APA和AS的鑒定增強了我們對轉錄異構體多樣性生物學作用的理解。在本研究中，確定了9035例AS事件，并將其分為五類（圖2）。在檢測到的全部轉錄本中，有6.86%由某種可變剪切形式產生，其中內含子保留是最常見的可變剪切事件。此外，在88092個基因位點上進一步確定了207955個APA事件。

圖2 APA和AS鑒定

2. lncRNAs鑒定

有904個lncRNAs在Pfam、CPC、CNCI和CPAT都有鑒定到（圖3A）。對lncRNAs進行分類和映射，發(fā)現(xiàn)基因間區(qū)的lncRNAs所占比例最多（688,76.1%）。

圖3 lncRNAs鑒定

3. lncRNAs和mRNAs在不同環(huán)境中的動態(tài)表達

共鑒定出1390個mRNAs（671個上調，719個下調）和50個lncRNAs（22個上調，28個下調）（圖4B和C）。在本研究中，預測DE-lncRNAs與其靶mRNA協(xié)同發(fā)揮其功能，從而說明珊瑚對環(huán)境變化的適應。對lncRNA靶向mRNAs進行KEGG富集分析，以探索鹿角珊瑚lncRNAs的功能。根據KEGG分析，DE-lncRNA靶向mRNA在五條途徑中顯著富集（q值<0.05），如ko00603鞘糖脂生物合成-球狀系列、ko00531氨基糖降解、ko00604鞘糖脂生物合成-神經節(jié)苷脂系列、ko00511其他聚糖降解、ko04142溶酶體、，ko00520氨基糖和核苷酸糖代謝，以及ko03013 RNA轉運。

圖4 lncRNAs和mRNAs在不同環(huán)境中的動態(tài)表達

4. 總結

珊瑚礁熱環(huán)境的變化促進了鹿角珊瑚的耐熱性。本研究首次對APA和AS進行了全面分析，并驗證了鹿角珊瑚對熱變化礁環(huán)境的反應中l(wèi)ncRNA-mRNA共表達網絡的有效性，這可能在其熱適應反應中起著關鍵作用。此外，作者猜想熱變化的珊瑚礁環(huán)境通過代謝調節(jié)促進了鹿角珊瑚的耐熱性，并且較低的代謝率與耐熱性的增加呈正相關。本文報告的數據提供了關于lncRNAs在鹿角珊瑚耐熱性中作用的重要信息，為進一步闡明lncRNAs在無脊椎動物環(huán)境應激反應中調控mRNA表達的機制提供了基礎。因此，這些發(fā)現(xiàn)表明，鹿角珊瑚在未來可能具有適應氣候變化的潛力。