基因組作為生命信息的承載體，蘊含著每種生物的全部遺傳信息。近年來，隨著測序技術的不斷發(fā)展，基因組學研究已經逐漸成為一項非常重要的基礎研究，而自然界中每個物種的基因組都有望被成功破譯。為了能讓更多想要進行基因組項目的科研工作者都能有個初步了解，今天小編整理了一些常見問題，一起來看看吧！

Question01：為什么要構建基因組？

Answer：基因組表示的是一個物種內全部的遺傳信息，沒有參考基因組使得關鍵基因無法被挖掘，調控機理難以被解析，成為科研的掣肘。而早期構建的參考基因組質量往往較差，導致①組裝不完整，可能遺失相當多的基因片段，想要的基因因為未被組裝到而被錯失。②連續(xù)性較差，短片段較多，且不利于研究由較長片段形成的與功能相關的基因。③拼接準確性有偏差，較短的片段在拼接時易因序列重復導致排序錯誤，從而影響后續(xù)相關研究的順利進行。甚者，所研究品種與已發(fā)表參考不同使得研究受到阻礙①相同的種下不同的品種/品系/變種比對率低，可用數(shù)據少；②雌雄性別差異，公布只有單個性別，找不到性別相關區(qū)域。

Question02：基因組的組裝難易程度主要由哪些方面影響？

Answer：①基因組大小?；蚪M越大，對應的重復序列往往越豐富，導致拼接的難度越高；②雜合度與重復序列比例。相同大小的基因組下，雜合度和重復比例越高，基因組組裝的連續(xù)性和完整性會越低（高雜合的基因組往往無法合并姊妹染色體，導致組裝的結果偏大，雜合位點容易拼接斷裂使得連續(xù)性降低，而重復序列在組裝中會被折疊，使組裝中出現(xiàn)缺口、錯誤，導致組裝的結果偏?。?。因此通常會需要適當增加測序深度以覆蓋這些復雜的區(qū)域。③基因組的倍性和倍型。難易程度由易至難分別為：二倍體＞異源多倍體＞同源多倍體。

Question03：如何知道物種基因組大小？

Answer：①已發(fā)表過基因組的可通過NCBI網站查詢：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/②未發(fā)表基因組的通過流式網站查詢：植物–https://cvalues.science.kew.org/?；動物：http://www.genomesize.com/③進行流式、survey（調研圖）進行分析

Question04：Survey是什么？可否不進行？

Answer：①Survey以二代測序技術為基礎，基于小片段文庫進行低深度測序，通過K-mer分析，快速獲得基因組大小、雜合度、重復序列比例等基本信息的研究方法。為制定該物種的全基因組de novo測序策略提供有效依據。②survey的二代數(shù)據具有糾錯和評估的重要作用，除非是已知基因組大小的單倍體等背景較為清晰的物種情況下，通過HiFi模式組裝，并且不需要做二代數(shù)據評估，可以考慮不進行，否則建議為必須進行。

Question05：為什么三代測序樣品要與二代survey測序樣品來自同一個個體？

Answer：①不同個體間會存在一定差異，若選材差異大可能會影響到三代測序策略的制定②二代數(shù)據需為Nanopore/Pacbio CLR模式基因組進行糾錯，避免因個體間序列差異影響糾錯效果③二代數(shù)據需回比組裝完成的基因組來評估該基因組組裝的完整性，避免因個體間序列差異降低比對率。

Question06：是否必須等Survey分析完之后才能啟動三代測序？

Answer：針對已知倍型倍性、已明確基因組大?。ㄍㄟ^流式等方式）或已經發(fā)表過同品種、近緣種材料的項目，可以同時啟動survey與三代測序，節(jié)約時間成本，使項目更快的推進。
若物種背景尚不完全明晰，需要先完成survey，再開展三代測序組裝。基于該物種基因組的大小、雜合及重復序列比例來制定合適的三代測序深度與數(shù)據量。

Question07：什么是HiFi測序？跟以前傳統(tǒng)的測序模式有什么區(qū)別？

Answer：目前PacBio Sequel II平臺可提供CLR library和HiFi library兩種模式，CLR文庫是傳統(tǒng)的組裝時構建的文庫類型，采用20 Kb、30 Kb等長片段類型的DNA進行文庫構建，獲得Subreads，單堿基準確率在85%左右，因此在基因組組裝前，需要通過canu等軟件進行數(shù)據糾錯后用于下一級應用。HiFi reads（High fidelity reads）是兼顧長讀長和高準確度的測序序列，即15Kb-20Kb片段文庫，進行單一片段多輪測序的方式來提升準確性，單堿基準確率可達99%。HiFi測序結合Hifiasm及HiCanu等軟件，可在較少的資源消耗下快速完成基因組的組裝，并保證結果的高準確性和連續(xù)性，尤其是對超大、超高雜合等復雜基因組具有明顯優(yōu)勢，同時也為高精度基因組注釋、變異檢測等應用提供了更有利的支持。

Question08：為什么PacBio HiFi測序只用幾十乘深度即可滿足分析需求

Answer：Nanopore與PacBio平臺CLR模式進行基因組組裝時，由于單堿基錯誤率在~85%左右，因此需要將下機reads先進行數(shù)據糾錯再進行基因組的組裝。因此會需要更高的測序深度來完成糾錯的步驟。而PacBio的HiFi模式得到的高一質性序列單堿基準確率可達99%，無需再次進行數(shù)據糾錯，因此僅幾十乘即可滿足高質量的組裝需求。

Question09：什么是染色體版本基因組？如何構建染色體水平的基因組？

Answer：染色體版基因組是指：將三代測序等方式拼接到的基因組序列分配至染色體組中，明確位置與方向向，使組裝的基因組達到染色體水平。常用的方式主要為Hi-C、遺傳圖譜或光學圖譜。

Question10：為何使用Hi-C進行染色體的掛載？其原理是什么

Answer：Hi-C技術將線性距離遠、空間結構近的DNA片段進行交聯(lián)富集后Pair-end測序，根據同一條染色體上的染色質片段互作頻率更高，不同染色體間的互作頻率較低的特點，推導出基因組的三維空間結構和基因之間可能的調控關系。利用Hi-C測序數(shù)據將Draft genome序列進行染色體群組的劃分，并確定各序列在染色體上的順序和方向，使基因組組裝組裝水平提升到染色體水平。
與其他技術相比，Hi-C具有以下優(yōu)點，因此具有更廣闊的發(fā)展①無需群體，單個個體就能實現(xiàn)染色體掛載；②標記密度更大，錨定染色體效率高，掛載率≥90%；③可以對已組裝的基因組進行糾錯；④分析周期短，準確性高

Question11：哪些參數(shù)可以評估構建的基因組？

Answer：①基因組大小及連續(xù)性（N50）：基因組組裝大小與調研圖一致、N50值越高越好。（通常contigN50值≥1Mb即可滿足絕大多數(shù)分析需求）②二代回比率：將二代高通量測序得到的短序列與組裝得到的基因組比對，通過統(tǒng)計比對率，可評估組裝基因組的完整性。③Busco/Cegma等數(shù)據庫評估：在組裝得到的基因組上查找軟件數(shù)據庫中的保守基因，通過找到的保守基因比例，評估基因組上基因組裝的完整性。④LAI評估，鑒定完整LTR-RTs占比。

Question12：為什么做基因組需要測RNA？還需要提供混組織的樣品？

Answer：在基因組組裝完之后需要對基因組的結構與功能進行預測與注釋。目前基因預測是從頭預測（基于結構）、同源預測（基于近緣物種）、轉錄組（基于表達基因）三部分結合進行研究，轉錄組所表達的即為最真實的情況，因此在基因預測的過程中具有重要的作用。而由于轉錄表達的時空特異性與組織特異性，為了獲得更全面的信息是需要進行多個組織部位混合檢測。

Question13：基因組做完之后可以開展什么研究？

Answer：基因組完成后可以進行比較基因組學分析，與近緣物種進行宏觀進化研究，其內容主要包括：(1)?基因家族聚類，分析特有、共有基因和基因家族；(2)?基因家族擴張收縮分析；(3)?系統(tǒng)發(fā)育樹的構建；(4)?物種分化時間推算；(5)LTR形成時間估算（一般為植物基因組的分析項）；(6)全基因組復制事件（一般為植物基因組的分析項）；(7)選擇壓力分析；(8)共線性分析。具體可見漲知識啦！比較基因組學研究那些事

尾聲

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