環(huán)境因素，包括抗生素，如四環(huán)素，可以改變植物的生理過程。為了了解細胞/組織對四環(huán)素的響應，采用多組學方法探討四環(huán)素影響黑麥草根系生長的分子機制。四環(huán)素引起植物根系代謝廣泛變化，特別是對類黃酮代謝途徑相關基因和代謝物的影響，揭示四環(huán)素脅迫下類黃酮的變化。本研究由百邁客提供代謝組、轉錄組和蛋白質組技術服務。

1、黑麥草根系對四環(huán)素極為敏感

四環(huán)素脅迫會限制黑麥草幼苗的生長，尤其是根系的生長。為了幫助理解四環(huán)素如何影響黑麥草根系的生長，通過生長模型發(fā)現(xiàn)，黑麥草根系表現(xiàn)出極端的生長抑制，但尚未出現(xiàn)強烈的葉生長抑制。通過測定黑麥草根系的代謝組、轉錄組和蛋白質組，從主成分分析可以看出，四環(huán)素對黑麥草根系的代謝物和基因有顯著影響。

2、四環(huán)素嚴重影響根系代謝組

為了評價四環(huán)素如何影響根的代謝活性，采用LC-MS在黑麥草根中獲得了821種代謝物。其中有230種代謝物?(P?<?0.05,?fold?change?(FC)>1.20或<?0.83)顯著上調或下調。

將230個代謝物基于其功能/通路的富集發(fā)現(xiàn)黑麥草根的次生代謝發(fā)生了很多明顯的變化。其中蘆丁、槲皮素、異槲皮苷(槲皮素-3-?o?-葡萄糖苷)、柚皮素、沒食子兒茶素和山柰酚的含量大幅下降。它們通過莽草酸和苯丙氨酸的代謝途徑產生。許多下調的類黃酮物質是抗氧化劑，在黑麥草的根中，這種保護反應被抑制，從而加重氧化應激。在四環(huán)素脅迫下，脅迫激素水楊酸及其相關代謝物5-甲氧基水楊酸的含量也降低了。類黃酮代謝在水楊酸誘導機制中起著重要的作用。水楊酸能增加類黃酮物質的積累。然而，與應激激素脫落酸相關的代謝物脫落酸葡萄糖酯(ABA-GE)在四環(huán)素處理下顯著增加，也與類黃酮的生物合成相關。已有研究報道，激素吲哚-3-乙酸在合適的濃度范圍內是植物的生長促進劑。在這里，5-甲氧基吲哚-3-乙酸（一個吲哚-3-乙酸類的成員）在四環(huán)素處理降低。然而，另一種激素吲哚-3-丙烯酸在四環(huán)素處理下增加，其對植物生長有抑制作用。

黑麥草根中與脂類代謝有關的物質(脂肪酸、磷脂、單萜類、甘油脂類、類固醇和其他脂類產物)也發(fā)生了變化。黑麥草根中許多脂類分解產物減少，脂肪酸增加。例如，脂分解中間體1-棕櫚酰甘油和脂分解產物膽堿、磷脂膽堿、磷脂酸(16:1/18:3)、磷脂酸(18:3/18:3)、溶血磷脂酰膽堿(12:0)、溶血磷脂酰膽堿(18:1)、溶血磷脂酰膽堿(16:1)含量在四環(huán)素處理下降低。相反，γ-亞麻酸、花生四烯酸和羥基脂肪酸脂肪酸酯(18:2/20:4)含量明顯升高。我們觀察到磷脂酰膽堿的含量沒有變化，而在四環(huán)素脅迫下脂解產物(磷脂和膽堿)下降，表明不飽和脂肪酸刺激了磷脂酰膽堿與磷脂酰膽堿的結合。磷脂酰膽堿/磷脂酰乙醇胺的比值增加，保護了膜的完整性。這些表明黑麥草的根中存在一種保護反應，能夠改善氧化應激。

3、四環(huán)素脅迫下根中類黃酮代謝基因下調

與對照組相比，在四環(huán)素處理下，10406個轉錄本顯著下調或上調(P<?0.05和FC>2.00或<0.50)。通過富集分析發(fā)現(xiàn)這些差異基因參與糖酵解/糖異生、精氨酸生物合成、氨基酸生物合成、碳代謝、丙酮酸代謝、檸檬酸循環(huán)(TCA循環(huán))、脂肪細胞脂解調節(jié)、晝夜節(jié)律誘導、cGMP-PKG信號通路、鞘脂信號通路、氧化磷酸化等生理過程。四環(huán)素脅迫下，黑麥草根系內質網蛋白加工、2-氧羧酸代謝、細胞凋亡等顯著增加(P?<?0.05，增加80%以上)。相比之下，類黃酮合成和花青素合成顯著降低(P?<?0.05，下降80%以上)。

4、四環(huán)素脅迫下根中類黃酮代謝蛋白下調

與對照組相比，在四環(huán)素處理下有273種蛋白質發(fā)生了顯著變化(P<?0.05)。KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，這些差異蛋白與類黃酮生物合成、氧化磷酸化、RNA降解、植物晝夜節(jié)律和α?-亞麻酸代謝相關。最顯著的是，在四環(huán)素脅迫下，與RNA降解相關的蛋白顯著增加(P?<?0.05，增加80%以上)。黃酮類化合物的生物合成和氧化磷酸化顯著減少(P?<?0.05，下降80%以上)。與轉錄組結果一致，黃酮類化合物的生物合成通路也是顯著降低。

5、四環(huán)素脅迫下的代謝過程

我們使用多組學分析來繪制四環(huán)素如何在轉錄和轉錄后水平上影響單個代謝過程。通過脂類和類黃酮(苯丙烷)的簡化代謝過程，研究了相關酶或其類似物/亞型的代謝通量、mRNA和蛋白質含量。四環(huán)素誘導的mrna和蛋白質含量的主要變化與代謝產物的變化相一致。例如，脂肪分解的減少與磷脂酶mrna含量的部分下降有關，而磷脂酶mrna含量的下降反過來又強烈地降低了膽堿、磷膽堿和磷脂酸的含量。尤其是催化磷脂酰膽堿轉化為磷酸膽堿的磷脂酶C，其mRNA水平下降了35%。但根中磷脂酶含量與對照無顯著差異。與脂質代謝相反，與類黃酮(苯丙烷)代謝相關的代謝物的變化似乎是由mrna和蛋白質的共同變化介導的，而這些變化反過來，全部或部分地改變了相應代謝物的含量。黃酮類代謝產物(柚皮素、山奈酚、槲皮素、異槲皮素和蘆丁)的減少與關鍵上游酶(查爾酮異構酶)mrna和蛋白的減少有關。類黃酮生物合成代謝產物(咖啡酸、阿魏酸和香草醛)的不變性與關鍵下游酶(咖啡酸3-?o?-甲基轉移酶和4-香豆酸輔酶a連接酶)的mrna和蛋白質的穩(wěn)定性有關，這表明在四環(huán)素脅迫下可能存在一種協(xié)同的類黃酮(苯丙烷)調節(jié)因子。

結論

我們通過多組學來量化黑麥草轉錄本、蛋白質和代謝物，為檢測四環(huán)素在根中的整體影響提供了一種有效的方法。將這些變化分配到細胞/組織過程中，然后確定可能受四環(huán)素影響的代謝途徑，通過比較mrna和蛋白質的變化可以很好地理解這些變化，從而確定這些變化是由轉錄和/或翻譯驅動的。通過這種方法，我們確定了四環(huán)素對次生代謝、脂質代謝、氨基酸代謝和碳水化合物代謝的影響。綜上所述，多組學分析為四環(huán)素脅迫下黑麥草根系的眾多細胞過程提供了全面的數(shù)據集。

 

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