期刊名稱：Molecular Plant

影響因子：21.949

發(fā)表單位：中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所

研究部位：高等植物及綠色生物

研究方法：磷酸化蛋白質(zhì)組、PRM靶向蛋白組

研究背景

2023年11月27日，中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所汪迎春團隊在Molecular Plant在線發(fā)表了題為GreenPhos, a universal method for in-depth measurement of plant phosphoproteomes with high quantitative reproducibility?的研究論文。論文中報道了一種具有突破性的植物磷酸化蛋白質(zhì)組學新技術。該技術采用了簡化、穩(wěn)健的工作流程，有效地克服了植物磷酸化蛋白質(zhì)組分析的主要技術難點，能高靈敏度、高特異性快速地富集植物磷酸肽。利用該技術可定量分析不同植物的磷酸蛋白質(zhì)組，其分析深度之深、定量重復性之高前所未有，有望成為植物磷酸蛋白組學的通用技術。由于該技術主要面向高等植物及其它綠色生物（如衣藻），且操作簡便，極大地降低了實驗所需的人力和試劑費用，因此命名為GreenPhos (綠磷)。

蛋白質(zhì)磷酸化在植物的生長、發(fā)育、環(huán)境適應以及作物的產(chǎn)量和品質(zhì)調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用。深度解析磷酸化蛋白質(zhì)組是全面理解磷酸化如何行使功能的有效手段。然而，與動物相比，植物磷酸化蛋白質(zhì)組的深度解析在技術上更具挑戰(zhàn)性。因為植物細胞具有致密的細胞壁和大量的包括色素在內(nèi)的次生代謝物，前者極大地增加了蛋白質(zhì)提取的難度，而后者嚴重地干擾了磷酸肽富集的效率和特異性。

實驗材料

野生型擬南芥(Col-0)幼苗在10%漂白劑中表面消毒，在無菌去離子水中漂洗，然后播種在含有1%瓊脂，pH為5.8的半強度Murashige和Skoog (1/2 MS)培養(yǎng)基上。種子在4℃的黑暗條件下發(fā)芽2天。幼苗在1/2 MS固體培養(yǎng)基上生長10天，然后轉(zhuǎn)移到1/2 MS液體培養(yǎng)基上，再培養(yǎng)16小時。在鹽脅迫實驗中，將幼苗轉(zhuǎn)移到添加或不添加(對照) 100mM NaCl的新鮮培養(yǎng)基中，根據(jù)需要孵育30 min或120 min。

研究結果

1.GreenPhos的開發(fā)——一種穩(wěn)定高效的純化植物磷酸肽的方法

從植物組織中高效提取蛋白質(zhì)是深入分析植物蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組的第一步和關鍵一步。為此，作者比較了SDS、GdnHCl和SDC等不同變性劑對擬南芥葉片中蛋白質(zhì)的提取性能。結果發(fā)現(xiàn)SDS-和SDC-提取的蛋白的性能相似，但優(yōu)于GdnHCl。植物樣品相較于動物樣品含有較低濃度的蛋白質(zhì)，因此作者優(yōu)化了磷酸化蛋白質(zhì)組的提取和富集的方法，即用SDS或GdnHCl緩沖液提取的蛋白質(zhì)樣品，在蛋白質(zhì)消化和隨后的磷酸肽富集之前，必須去除變性劑(圖1A)。接著用氯仿-甲醇沉淀提取的樣品，去除變性劑和其他干擾生物分子(圖1A和1B)。而作者通過實驗發(fā)現(xiàn)，SDC法提取的蛋白樣本不需要經(jīng)過氯仿-甲醇沉淀，而鑒定到的磷酸化蛋白更多，同時需要的植物材料更少。因此作者認為SDC法更節(jié)省成本達到更好的效果，并在番茄、水稻、綠藻等生物中得到驗證，從而確定了磷酸化蛋白組學的方法，稱之為GreenPhos。

2.?GreenPhos與當前磷酸肽富集方法的比較

GreenPhos與當前基于polyMAC的磷酸肽制備方法相比，在上機蛋白等量的情況下，GreenPhos方法平均鑒定出11072個磷酸化位點，而polymac法鑒定出9399個磷酸化位點 (圖2B)，表明GreenPhos的分析深度比PolyMAC的高18%，并且需要的樣本量更少，省去了更多的實驗步驟和時間。與此同時，作者發(fā)現(xiàn)GreenPhos的富集選擇性(92%)也高于PolyMAC的富集選擇性(54%)（圖2C）?？赡茉蚴谴紊x物的存在影響了磷酸肽對TiO2珠的親和力，PolyMAC優(yōu)先富集磷酸化肽，而GreenPhos富集了更多的雙重或多重磷酸化肽(圖2D-E)。總之，在當前實驗條件下，GreenPhos優(yōu)于基于polyMAC的方法。

3.GreenPhos的靈敏度和定量性能

為了進一步測試GreenPhos的效率和靈敏度，作者從擬南芥葉片中提取蛋白質(zhì)(100、300、600和900μg)，分別從4個樣品中分別富集磷酸肽，并通過LC-MS分析（圖3A）。通過比較鑒定出的磷位點和磷酸肽的數(shù)量，發(fā)現(xiàn)兩者都隨著上機量的增加而增加，達到600μg后鑒定出的磷酸化位點和磷酸化肽的小幅增加 (圖3A和3B)。說明鑒定的磷酸化位點的數(shù)量與起始蛋白的數(shù)量不存在正相關，因為LC-MS在使用相同的獲取參數(shù)時是飽和的。

為了評估GreenPhos在定量磷酸化蛋白質(zhì)組學中的潛力，作者了鑒定的磷酸化肽與上機量之間的定量關系。以900μg為參照，在100、300和600μg中，檢測到的磷酸肽強度比與參考中磷酸肽強度比的中位數(shù)與理論值具有很好的相關性(圖3C)。分析結果表明，GreenPhos與單次LC-MS結合可用于從高達600μg的蛋白質(zhì)中定量磷酸肽，準確度高。通過5次重復質(zhì)譜分析，評價了GreenPhos在植物磷蛋白組定量鑒定中的再現(xiàn)性。5個生物重復和5個技術重復的磷酸肽強度的Pearson相關系數(shù)平均分別為0.95和0.97 (圖3D和3E)，表明具有較高的定量可重復性。從5個生物重復中共鑒定出磷酸化位點14063個，其中74%的磷酸化位點至少在2個重復中鑒定出 (圖3F)。結果表明，GreenPhos可以在定量和定性上產(chǎn)生高度可重復性的結果。

4.?利用GreenPhos對擬南芥鹽脅迫誘導的磷酸化蛋白組分析

為了深入了解擬南芥對鹽脅迫響應中蛋白磷酸化介導的信號，作者使用GreenPhos和單次LC-MS檢測，分析了100 mM NaCl處理30分鐘(T30)和120分鐘(T120)或未處理(T0)的擬南芥幼苗的磷酸化蛋白質(zhì)組學(圖4A)。每個處理包括3個生物學重復，每個重復600μg蛋白用于磷酸肽的富集?？偣矎?316個磷酸化蛋白中鑒定出12908個磷酸肽，含有15889個磷酸化位點。在磷酸肽中，13473個磷酸位點在處理的至少一個重復中包含可量化的信息。

對三個重復中至少任意兩個重復中的11128個磷酸位點進行了label free定量。采用p< 0.05篩選不同處理間存在差異的磷酸化位點。聚類分析顯示，磷酸化蛋白形成了四個不同的簇，顯示了鹽脅迫誘導的磷酸化水平在所有處理中表現(xiàn)出顯著差異(圖4B)。在簇1中，磷酸化水平在鹽脅迫30 min后適度下降，在120 min后升高。在簇2中，磷酸化水平在30 min時總體上升，而在120 min后維持在相似的水平。在簇3中，磷酸化水平在30 min時沒有顯著變化，在120 min時下降。在簇4中，磷酸化水平在30 min鹽脅迫下下降，并在120 min時維持在類似的水平。

使用Fisher’s-exact對每個簇中的磷酸化蛋白進行GO和KEGG富集分析(圖5)。與報道一致，在細胞組分條目，細胞核、細胞質(zhì)和細胞膜蛋白在所有簇中被顯著富集。在分子功能條目，激酶活性在簇1、2和4中富集，而在簇3中不富集，但是蛋白質(zhì)去磷酸化的在生物過程條目在簇3中富集。結果表明，激酶的磷酸化激活和磷酸酶的去磷酸化是鹽脅迫誘導的重要反應。

5.?磷酸化motif分析顯示鹽脅迫誘導多種激酶的差異激活

激酶通常通過識別特定的序列motif來磷酸化它們的底物，即磷酸化motif。使用motif-x算法?(https://meme-suite.org/meme/tools/momo)選擇在任意兩個處理中表現(xiàn)出差異水平的磷酸化位點進行磷酸化motif分析。在處理T30/T0之間顯示磷酸化增加的磷酸化位點中，四個motif?(SP、SDxE、SDxD和LxxxxS)被過度表達，而兩個motif?(SP和RxxS)在顯示磷酸化降低的磷酸化位點中過度表達(圖6A)。同樣，在120 min鹽脅迫(T120/T0)下，在磷酸化位點中，分別有4個motif（SP、SDxE、SDxD和SxxE）和3個motif（SP、RxxS、SxxE）的水平升高或降低(圖6B)。兩種處理(T120/T30)的比較顯示，在120 min鹽脅迫下，兩個motif（SP、SD）和motif（SP）在磷酸化位點中被過度表達，分別表現(xiàn)出更高和更低的磷酸化水平(圖6C)。

在所有處理中，富含脯氨酸的motif (SP)在上調(diào)和下調(diào)的磷酸位點中都被過度表達，并且通過PRM進一步驗證了β-淀粉酶1 (BAM1)上含有S55的一個motif (圖6)。緊接著作者鑒定了5個CDPKs的12個磷酸位點和3個MAPK上的4個磷酸位點，包括MPK19激活環(huán)上的一個磷酸位點，這些激酶被認為和鹽脅迫相關。綜上所述，包括MAPKs和CDPKs在內(nèi)的多種激酶在鹽脅迫中起作用。

6.?剪接體蛋白在鹽脅迫下發(fā)生不同程度的磷酸化

除了激酶外，在簇1、2和4中剪接體被KEGG通路顯著富集 (圖5)，暗示磷酸化調(diào)控mRNA的可變剪接，是植物響應脅迫的關鍵過程。在鹽脅迫下，18個剪接體蛋白上共有28個不同的位點被差異磷酸化 (圖7)。利用PRM進一步驗證了Y209在SCL30上的差異磷酸化(圖6)。據(jù)報道，RNA解旋酶及其磷酸化對剪接體的組裝至關重要。在鹽脅迫30分鐘后，Prp5的S210、S442和S444位點磷酸化增加，并在120分鐘后保持高水平，Prp19的多個亞基也觀察到類似的磷酸化模式(圖7)。盡管這些差異磷酸化事件的意義尚未得到明確的證明，但它們可能參與了鹽脅迫誘導的mRNA剪接的調(diào)控。

研究總結

GreenPhos不僅極大地提高了植物磷酸化蛋白質(zhì)組的解析效率，而且也顯著地減低了實驗操作的難度和成本，為更深入地理解蛋白質(zhì)磷酸化在植物生命過程中的功能提供了強有力的工具。該研究成果將有效推進磷酸化蛋白質(zhì)組學與植物生物學和農(nóng)學等領域的交叉融合，在發(fā)掘與作物產(chǎn)量、品質(zhì)以及抗逆密切相關的磷酸化蛋白及其位點中有著廣泛的應用前景。

參考文獻：

Duan?X,?Zhang?Y,?Huang?X,?Ma?X,?Gao?H,?Wang?Y,?Xiao?Z,?Huang?C,?Wang?Z,?Li?B,?Yang?W,?Wang?Y.?GreenPhos,?a?universal?method?for?in-depth?measurement?of?plant?phosphoproteomes?with?high?quantitative?reproducibility.?Mol?Plant.?2023?Nov?27:S1674-2052(23)00393-3.?doi:?10.1016/j.molp.2023.11.010.?Epub?ahead?of?print.?PMID:?38018035.